| 目录 | 第1-6页 |
| 名词简写 | 第6-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 第一章 综述 | 第11-18页 |
| 1 重组工程 | 第11-15页 |
| ·重组简介 | 第11-12页 |
| ·Rac噬菌体编码的RecET重组系统 | 第11页 |
| ·来源于λ噬菌体的Red重组系统 | 第11-12页 |
| ·Red重组系统介导的质粒修饰 | 第12-13页 |
| ·Red重组介导染色体上基因的修饰 | 第13-15页 |
| 2 TEV蛋白酶 | 第15-18页 |
| ·TEV蛋白酶简介 | 第15-16页 |
| ·TEV蛋白酶的应用 | 第16-18页 |
| 第二章 BL21(DE3)重组体系的建立 | 第18-38页 |
| 第一节 BL21(DE3)基因组上基因敲除的验证 | 第18-26页 |
| 1 实验材料 | 第18-20页 |
| ·菌种和质粒 | 第18页 |
| ·引物合成和测序 | 第18-19页 |
| ·培养基和缓冲液的配制 | 第19-20页 |
| ·主要工具酶和化学试剂 | 第20页 |
| ·实验仪器设备及来源 | 第20页 |
| 2 实验方法 | 第20-24页 |
| ·常规的分子生物学操作方法 | 第20-23页 |
| ·制备大肠杆菌DH10B电转化感受态细胞及转化DNA | 第20-21页 |
| ·PCR方法扩增目的片段 | 第21页 |
| ·常用的PCR反应条件 | 第21页 |
| ·菌落PCR | 第21-22页 |
| ·酶切反应 | 第22页 |
| ·目的DNA片段的回收 | 第22页 |
| ·DNA连接反应 | 第22页 |
| ·质粒提取 | 第22-23页 |
| ·重组酶表达质粒 | 第23页 |
| ·诱导重组酶表达的电转感受态的制备 | 第23-24页 |
| ·同源重组介导将HA-S-neo-S-HA融合到BL21(DE3)基因组中 | 第24页 |
| 3 实验结果 | 第24-26页 |
| ·重组片段的扩增 | 第24-25页 |
| ·敲除结果验证 | 第25-26页 |
| 4 小结 | 第26页 |
| 第二节 BL21(DE3)hsdR的敲除及效率验证 | 第26-38页 |
| 1 实验材料 | 第26-29页 |
| ·菌种和质粒 | 第26-28页 |
| ·培养基和缓冲液的配制 | 第28页 |
| ·主要工具酶及化学试剂 | 第28页 |
| ·主要仪器设备及来源 | 第28页 |
| ·引物合成与测序 | 第28-29页 |
| 2 实验方法 | 第29-30页 |
| ·常规分子生物学操作方法 | 第29页 |
| ·重组酶表达质粒(2.1,2.2见第二章第一节) | 第29页 |
| ·利用I-SceI消除卡那霉素抗性片段的方法 | 第29-30页 |
| 3 结果 | 第30-37页 |
| ·HA-S-neo-S-HA基因敲入的实验 | 第30-34页 |
| ·基于归巢内切酶I-SceI双链断裂消除抗性 | 第34-35页 |
| ·电转化效率的比较 | 第35-37页 |
| 4. 小结 | 第37-38页 |
| 第三章 TEV蛋白酶细胞内剪切融合蛋白体系的构建 | 第38-50页 |
| 第一节 TEV蛋白酶细胞内剪切融合蛋白体系的碳素 | 第38-45页 |
| 1. 实验材料 | 第38-41页 |
| ·菌种和质粒 | 第38-39页 |
| ·培养基的配置 | 第39页 |
| ·主要工具酶及化学试剂 | 第39页 |
| ·主要仪器设备及来源 | 第39页 |
| ·引物合成与测序 | 第39-41页 |
| 2 实验方法 | 第41-42页 |
| ·常规分子生物学操作方法 | 第41页 |
| ·重组酶表达质粒 | 第41页 |
| ·同源重组介导将HA-mTEV-bla-HA融合到BL21(DE3)基因组中 | 第41-42页 |
| 3 实验结果 | 第42-45页 |
| ·质粒的构建 | 第42页 |
| ·重组片段的扩增 | 第42-43页 |
| ·重组工程介导重组片段整合到BL21(DE3)基因组中基因型的验证 | 第43页 |
| ·TEV蛋白酶的表达 | 第43-44页 |
| ·TEV蛋白酶和融合蛋白的共表达 | 第44-45页 |
| 第二节 BL21(DE3)-tetR-ptetA-mTEV的构建 | 第45-50页 |
| 1 实验材料 | 第45-47页 |
| ·所用菌株和质粒 | 第45-46页 |
| ·培养基的配置 | 第46页 |
| ·主要工具酶及化学试剂 | 第46页 |
| ·主要仪器设备及来源 | 第46页 |
| ·引物合成与测序 | 第46-47页 |
| 2 实验方法 | 第47页 |
| 3 实验结果 | 第47-48页 |
| ·相关质粒(pR6KMCS和pLS1921)的构建 | 第47-48页 |
| ·重组片段(HA-cat-tetR-ptetA-HA)的扩增 | 第48页 |
| ·重组子基因型的验证 | 第48页 |
| 4 小结 | 第48-50页 |
| 参考文献 | 第50-53页 |
| 附录 | 第53-54页 |
| 致谢 | 第54页 |
