| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-5页 |
| 目录 | 第5-8页 |
| 第一章 绪论 | 第8-14页 |
| ·胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的概况 | 第8-9页 |
| ·GLP-1 的结构 | 第8页 |
| ·GLP-1 的生理功能 | 第8页 |
| ·GLP-1 长效性研究 | 第8-9页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第9-11页 |
| ·毕赤酵母简介 | 第9页 |
| ·毕赤酵母宿主菌及表达载体 | 第9-10页 |
| ·提高外源蛋白在毕赤酵母系统中的表达量的研究 | 第10-11页 |
| ·解决外源蛋白表达过程中的降解问题的研究 | 第11页 |
| ·CRE/LOXP 系统重组 | 第11-12页 |
| ·Cre/loxp 系统重组原理 | 第11-12页 |
| ·Cre/loxp 敲除系统在毕赤酵母中的应用 | 第12页 |
| ·立题意义和研究内容 | 第12-14页 |
| ·立题意义 | 第12-13页 |
| ·研究内容 | 第13-14页 |
| 第二章 STE13 基因缺陷型菌株的构建 | 第14-27页 |
| ·材料 | 第14-15页 |
| ·主要仪器 | 第14-15页 |
| ·主要试剂 | 第15页 |
| ·菌株及质粒 | 第15页 |
| ·培养基 | 第15页 |
| ·实验方法 | 第15-24页 |
| ·STE13 基因的扩增及测序验证 | 第15-16页 |
| ·同源臂片段的扩增与回收 | 第16-17页 |
| ·融合上下同源臂片段并连入 T 载体 | 第17-19页 |
| ·阳性转化子的验证 | 第19-20页 |
| ·Cre-ZeoR 片段的扩增 | 第20页 |
| ·Cre-ZeoR 片段连入 UD/T 质粒 | 第20-21页 |
| ·UCD 质粒的 PCR 验证 | 第21-22页 |
| ·线性化质粒 UCD/pMD 19-T | 第22页 |
| ·毕赤酵母 GS115/W 感受态制备及电转化 | 第22-23页 |
| ·毕赤酵母阳性重组子的筛选及 PCR 验证 | 第23-24页 |
| ·结果与讨论 | 第24-26页 |
| ·融合蛋白 GGH 的 N 端序列分析 | 第24-25页 |
| ·STE13 基因的 PCR 扩增及测序验证 | 第25页 |
| ·UCD 融合片段构建流程 | 第25页 |
| ·UCD/pMD 19-T 质粒的 PCR 及酶切验证 | 第25-26页 |
| ·本章小结 | 第26-27页 |
| 第三章 STE13 基因缺陷菌株与出发菌株的比较 | 第27-36页 |
| ·材料 | 第27-28页 |
| ·主要仪器 | 第27页 |
| ·主要试剂 | 第27-28页 |
| ·菌株及质粒 | 第28页 |
| ·培养基 | 第28页 |
| ·实验方法 | 第28-30页 |
| ·毕赤酵母基因组提取 | 第28页 |
| ·诱导去除抗性标签并进行二次 PCR 验证 | 第28-29页 |
| ·STE13 缺陷菌株 GS115/D13 与出发菌株 GS115/W 摇床诱导对比 | 第29页 |
| ·诱导条件对重组菌 GS115/D13 表达量的影响 | 第29-30页 |
| ·诱导时间对 GS115/D13 表达量的影响 | 第29-30页 |
| ·甲醇浓度诱导对 GS115/D13 表达量的影响 | 第30页 |
| ·诱导温度对 GS115/D13 表达量的影响 | 第30页 |
| ·融合蛋白 GGH 转 PVDF 膜及 N 端测序 | 第30页 |
| ·结果与讨论 | 第30-35页 |
| ·毕赤酵母基因组的提取 | 第30-31页 |
| ·PCR 验证 STE13 基因的敲除 | 第31-32页 |
| ·STE13 缺陷菌株与出发菌株的生长曲线与蛋白表达量的比较 | 第32页 |
| ·诱导时间对重组菌 GS115/D13 表达的影响 | 第32-33页 |
| ·甲醇浓度诱导对重组菌 GS115/D13 表达的影响 | 第33-34页 |
| ·温度对重组菌 GS115/D13 表达的影响 | 第34页 |
| ·融合蛋白 GGH 转膜及 N 端测序 | 第34-35页 |
| ·本章小结 | 第35-36页 |
| 第四章 重组菌 GS115/D13 中 GGH 的分离纯化及活性评价 | 第36-44页 |
| ·材料 | 第36-37页 |
| ·主要仪器 | 第36-37页 |
| ·主要试剂 | 第37页 |
| ·菌株 | 第37页 |
| ·实验方法 | 第37-39页 |
| ·融合蛋白 GGH 超滤浓缩 | 第37页 |
| ·Blue Sepharose Fast Flow 层析 | 第37页 |
| ·Phenyl Sepharose Fast Flow 层析 | 第37-38页 |
| ·Q Sepharose Fast Flow 层析 | 第38页 |
| ·凝胶 Sephadex G25 层析： | 第38页 |
| ·融合蛋白 GGH 浓度检测 | 第38页 |
| ·融合蛋白 GGH 活性评价 | 第38-39页 |
| ·结果与讨论 | 第39-42页 |
| ·融合蛋白 GGH 超滤浓缩 | 第39页 |
| ·AKTA 分离纯化结果 | 第39-41页 |
| ·融合蛋白 GGH 的纯化工艺 | 第41页 |
| ·融合蛋白 GGH 浓度鉴定 | 第41-42页 |
| ·融合蛋白 GGH 的活性评价 | 第42页 |
| ·本章小结 | 第42-44页 |
| 第五章 结论与展望 | 第44-45页 |
| ·主要结论 | 第44页 |
| ·存在的问题 | 第44-45页 |
| 致谢 | 第45-46页 |
| 参考文献 | 第46-50页 |
| 附录 1：核苷酸序列 | 第50-52页 |
| 附录 2：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第52页 |
