| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第一章 绪论 | 第18-26页 |
| 1.1 生物膜简介 | 第18页 |
| 1.2 膜蛋白论述 | 第18-19页 |
| 1.2.1 膜蛋白结构分类 | 第19页 |
| 1.2.2 膜蛋白功能介绍 | 第19页 |
| 1.3 合成生物学 | 第19-20页 |
| 1.4 蛋白质工程 | 第20-21页 |
| 1.5 代谢调控 | 第21页 |
| 1.6 生物信息学 | 第21-23页 |
| 1.6.1 核酸序列分析 | 第22页 |
| 1.6.2 蛋白质序列分析和结构预测 | 第22页 |
| 1.6.3 生物信息学分析常用软件 | 第22-23页 |
| 1.7 基因编辑技术发展 | 第23-24页 |
| 1.7.1 RecA重组系统 | 第23页 |
| 1.7.2 RedA系统 | 第23页 |
| 1.7.3 ZFN/TALE技术 | 第23-24页 |
| 1.7.4 Cas系统 | 第24页 |
| 1.8 立项意义 | 第24-26页 |
| 第二章 肺炎克雷伯氏菌膜蛋白的结构分析及研究进展 | 第26-40页 |
| 2.1 引言 | 第26页 |
| 2.2 肺炎克雷伯氏菌膜蛋白研究进展 | 第26-28页 |
| 2.2.1 外膜蛋白 | 第26页 |
| 2.2.4 内膜蛋白 | 第26-27页 |
| 2.2.5 膜蛋白研究进展 | 第27-28页 |
| 2.3 肺炎克雷伯氏菌膜蛋白跨膜区域和功能概括 | 第28-39页 |
| 2.4 本章小结 | 第39-40页 |
| 第三章 肺炎克雷伯氏菌膜蛋白基因敲除菌株构建 | 第40-52页 |
| 3.1 引言 | 第40页 |
| 3.2 实验材料 | 第40-41页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第40页 |
| 3.2.2 培养基及菌株培养条件 | 第40-41页 |
| 3.2.3 试剂与仪器 | 第41页 |
| 3.3 实验方法 | 第41-46页 |
| 3.3.1 RecA系统 | 第42页 |
| 3.3.2 构建基因敲除打靶载体 | 第42页 |
| 3.3.3 基因组模板和质粒pET-28a质粒提取 | 第42-43页 |
| 3.3.4 目的基因和菌落PCR和产物回收 | 第43-44页 |
| 3.3.5 双酶切目的基因和质粒 | 第44页 |
| 3.3.6 琼脂糖凝胶电泳切胶回收 | 第44页 |
| 3.3.7 目的基因与质粒pET-28a连接 | 第44-45页 |
| 3.3.8 双酶切验证 | 第45页 |
| 3.3.9 热转化法和电转化法 | 第45-46页 |
| 3.4 膜蛋白基因敲除菌株构建 | 第46-47页 |
| 3.4.1 单基因敲除 | 第46页 |
| 3.4.2 双基因敲除 | 第46页 |
| 3.4.3 pspD基因敲除菌株的构建 | 第46-47页 |
| 3.4.4 pspA基因敲除菌株的构建 | 第47页 |
| 3.4.5 双基因敲除菌株的构建 | 第47页 |
| 3.5 实验结果与讨论 | 第47-51页 |
| 3.5.1 目的基因敲除及验证 | 第47-50页 |
| 3.5.2 影印法消除重组型质粒 | 第50-51页 |
| 3.6 本章小结 | 第51-52页 |
| 第四章 探究pspA和pspD基因对K.Pneumoniae蛋白表达的影响 | 第52-66页 |
| 4.1 引言 | 第52页 |
| 4.2 SDS-PAGE | 第52-53页 |
| 4.2.1 样品及处理方法 | 第52页 |
| 4.2.2 蛋白电泳配制方法 | 第52-53页 |
| 4.2.3 实验方法 | 第53页 |
| 4.3 MADLI-TOF/TOF-MS | 第53-54页 |
| 4.3.1 MALDI-TOF/TOF-MS检测差异性蛋白条带 | 第53-54页 |
| 4.4 Real Time PCR探究膜蛋白基因对K.Pneumoniae转录水平的影响 | 第54-55页 |
| 4.4.1 实验材料 | 第54页 |
| 4.4.2 Real Time PCR所用引物设计 | 第54-55页 |
| 4.5 Western Blot探究膜蛋白基因对K.Pneumoniae翻译水平的影响 | 第55-57页 |
| 4.5.1 实验材料与仪器 | 第55-56页 |
| 4.5.2 实验方法 | 第56-57页 |
| 4.6 结果与讨论 | 第57-64页 |
| 4.6.1 SDS-PAGE检测突变菌株蛋白水平表达的变化 | 第57-58页 |
| 4.6.2 MALDI-TOF-MS检测差异性蛋白条带结果 | 第58-61页 |
| 4.6.3 荧光定量PCR——转录水平检测 | 第61-64页 |
| 4.6.4 Western Blot翻译水平检测 | 第64页 |
| 4.7 本章小结 | 第64-66页 |
| 第五章 pspA和pspD蛋白对K.Pneumoniae表面形态影响的探究 | 第66-70页 |
| 5.1 引言 | 第66页 |
| 5.2 扫描电子显微镜(SEM) | 第66-67页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第66页 |
| 5.2.2 实验方法 | 第66-67页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第67-68页 |
| 5.3.1 SEM观察突变菌株表现形态变化 | 第67页 |
| 5.3.2 AFM观察突变菌株表面形态变化 | 第67-68页 |
| 5.4 本章小结 | 第68-70页 |
| 第六章 探究膜蛋白pspA和pspD对K.Pneumoniae代谢的影响 | 第70-74页 |
| 6.1 引言 | 第70页 |
| 6.2 实验材料 | 第70-71页 |
| 6.2.1 实验菌株与材料 | 第70-71页 |
| 6.3 实验方法 | 第71页 |
| 6.3.1 摇瓶发酵培养 | 第71页 |
| 6.3.2 生物量检测 | 第71页 |
| 6.3.3 代谢底物消耗测定 | 第71页 |
| 6.4 甘油/葡萄糖为底物发酵 | 第71-73页 |
| 6.4.1 以甘油为底物发酵结果 | 第71-72页 |
| 6.4.2 以葡萄糖为底物发酵结果 | 第72-73页 |
| 6.5 本章小结 | 第73-74页 |
| 第七章 结论 | 第74-76页 |
| 7.1 总结 | 第74-75页 |
| 7.2 创新点 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-82页 |
| 附录 | 第82-84页 |
| 附录1 试剂 | 第82-83页 |
| 附录2 仪器 | 第83-84页 |
| 致谢 | 第84-86页 |
| 研究成果及发表的论文 | 第86-88页 |
| 导师和作者简介 | 第88-90页 |
| 硕士研宄生学位论文答辩委员会决议书 | 第90-91页 |
