| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-14页 |
| 第1章 文献综述(一) | 第14-22页 |
| ·萘普生简介 | 第14-16页 |
| ·手性 | 第14页 |
| ·手性药物 | 第14-15页 |
| ·非甾体类抗炎药——萘普生 | 第15-16页 |
| ·酯酶简介 | 第16-18页 |
| ·化学法合成(S)-萘普生 | 第18页 |
| ·(S)-萘普生的酶法拆分 | 第18-20页 |
| ·脂肪酶在萘普生拆分中的应用 | 第19-20页 |
| ·酯酶在萘普生拆分中的应用 | 第20页 |
| ·研究目的和意义 | 第20页 |
| ·研究思路和内容提要 | 第20-22页 |
| 第2章 酯酶的制备及其在萘普生甲酯酶促拆分中的应用 | 第22-37页 |
| ·引言 | 第22页 |
| ·材料与方法 | 第22-28页 |
| ·菌种、试剂和培养基 | 第22-23页 |
| ·主要仪器和设备 | 第23页 |
| ·实验方法 | 第23-28页 |
| ·酯酶的克隆、表达及粗酶的获得 | 第23-25页 |
| ·酯酶酶活力及蛋白测定方法 | 第25页 |
| ·酯酶催化不同链长脂肪酸的对硝基苯酚酯的水解反应速率 | 第25-26页 |
| ·HPLC法测定酯酶对萘普生酯的催化活性和对映选择性 | 第26页 |
| ·产物浓度标准曲线的绘制 | 第26页 |
| ·酯酶催化萘普生甲酯水解反应条件优化 | 第26页 |
| ·(S)-萘普生的酶促拆分重复批式制备 | 第26-28页 |
| ·结果与讨论 | 第28-36页 |
| ·酯酶的克隆与表达 | 第28-29页 |
| ·酯酶对对硝基苯酚酯的底物特异性 | 第29-30页 |
| ·酯酶水解拆分萘普生甲酯的反应条件优化 | 第30-35页 |
| ·温度的影响 | 第31-32页 |
| ·pH的影响 | 第32页 |
| ·吐温-80浓度的影响 | 第32-33页 |
| ·底物浓度的影响 | 第33-34页 |
| ·产物甲醇的影响 | 第34页 |
| ·产物萘普生的抑制作用 | 第34-35页 |
| ·(S)-萘普生的酶促拆分重复批式制备 | 第35-36页 |
| ·本章小结 | 第36-37页 |
| 第3章 文献综述(二) | 第37-52页 |
| ·生物能源异丁醇 | 第37-41页 |
| ·生物能源简介 | 第37-38页 |
| ·生物能源异丁醇及其研究进展 | 第38-41页 |
| ·醇脱氢酶 | 第41-45页 |
| ·醇脱氢酶简介 | 第41-42页 |
| ·醇脱氢酶的三维结构 | 第42-44页 |
| ·辅酶结合域 | 第43页 |
| ·催化域 | 第43-44页 |
| ·锌离子 | 第44页 |
| ·醇脱氢酶的催化机理 | 第44-45页 |
| ·醇脱氢酶的构象变化 | 第45页 |
| ·醇脱氢酶在异丁醇生物合成中的作用 | 第45页 |
| ·蛋白质定向进化 | 第45-50页 |
| ·蛋白质定向进化技术简介 | 第45-46页 |
| ·突变文库的构建方法 | 第46-48页 |
| ·随机突变 | 第46-47页 |
| ·饱和突变 | 第47-48页 |
| ·DNA重组 | 第48页 |
| ·突变文库的高通量筛选策略 | 第48-49页 |
| ·定向进化研究进展 | 第49-50页 |
| ·研究目的和意义 | 第50页 |
| ·研究思路和内容提要 | 第50-52页 |
| 第4章 醇脱氢酶的定向进化 | 第52-71页 |
| ·引言 | 第52页 |
| ·定向进化技术路线 | 第52-53页 |
| ·材料和方法 | 第53-60页 |
| ·菌株、引物、试剂和培养基 | 第53-54页 |
| ·主要仪器、设备及分析软件 | 第54-55页 |
| ·实验方法 | 第55-60页 |
| ·定向进化起点的选择 | 第55页 |
| ·突变文库的构建 | 第55-57页 |
| ·高通量筛选 | 第57-58页 |
| ·醇脱氢酶的大量表达和粗酶的获得 | 第58页 |
| ·醇脱氢酶的纯化 | 第58-59页 |
| ·醇脱氢酶及其有益突变体的表征 | 第59页 |
| ·醇脱氢酶活力的测定 | 第59页 |
| ·异丁醇厌氧发酵质粒和菌株的构建以及异丁醇的发酵生产 | 第59页 |
| ·发酵产物异丁醇的分析 | 第59-60页 |
| ·结果和讨论 | 第60-70页 |
| ·定向进化起点的选择 | 第60页 |
| ·高通量筛选方法的建立 | 第60-61页 |
| ·醇脱氢酶LlAdhA的定向进化 | 第61-66页 |
| ·第1轮——随机突变 | 第61-62页 |
| ·第2轮——组合突变 | 第62页 |
| ·第3轮——随机突变 | 第62-63页 |
| ·第4轮——定点饱和突变 | 第63页 |
| ·第5轮——组合突变 | 第63页 |
| ·第6轮——活性中心序列随机突变 | 第63-64页 |
| ·第7轮——密码子偏好组合突变 | 第64页 |
| ·第8轮——定点饱和突变 | 第64-65页 |
| ·第9轮——随机突变 | 第65页 |
| ·定向进化小结 | 第65-66页 |
| ·突变体的表征 | 第66-68页 |
| ·热稳定性——T_(50)值 | 第66页 |
| ·辅酶NADH的K_M值 | 第66-67页 |
| ·催化异丁醇氧化的K_M值 | 第67页 |
| ·底物特异性 | 第67-68页 |
| ·定向进化导致的异丁醇产量的提高 | 第68-70页 |
| ·本章小结 | 第70-71页 |
| 第5章 醇脱氢酶及其突变体的晶体结构和结构解析 | 第71-82页 |
| ·引言 | 第71页 |
| ·材料和方法 | 第71-73页 |
| ·菌种、试剂及培养基 | 第71页 |
| ·主要仪器、设备及分析软件 | 第71页 |
| ·实验方法 | 第71-73页 |
| ·AdhA和突变体RE1在大肠杆菌中的大量表达和纯化 | 第71-72页 |
| ·晶体的获得 | 第72页 |
| ·X射线晶体衍射和数据收集 | 第72页 |
| ·分子置换和结构精修 | 第72-73页 |
| ·结构分析与建模 | 第73页 |
| ·蛋白质数据库录入编号 | 第73页 |
| ·结果和讨论 | 第73-81页 |
| ·LlAdhA的结构表征 | 第73-77页 |
| ·定向进化的结构基础 | 第77-81页 |
| ·突变体RE1对异丁醛活性提高的结构基础 | 第77-79页 |
| ·突变N110S对突变体29C8活力提高的作用 | 第79-80页 |
| ·定向进化对热稳定性的影响 | 第80页 |
| ·定向进化对底物特异性的影响 | 第80-81页 |
| ·本章小结 | 第81-82页 |
| 第6章 总结与展望 | 第82-85页 |
| ·全文总结 | 第82-83页 |
| ·论文创新点 | 第83-84页 |
| ·工作展望 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-96页 |
| 附录1 | 第96-97页 |
| 附录2 | 第97-100页 |
| 附录3 | 第100-101页 |
| 附录4 | 第101-102页 |
| 附录5 | 第102-103页 |
| 附录6 | 第103-104页 |
| 攻读博士期间撰写的论文与专利 | 第104-105页 |
| 致谢 | 第105页 |
