| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-12页 |
| 本文缩写词表 | 第12-13页 |
| 1.绪论 | 第13-23页 |
| ·溶栓药物的研究现状 | 第13-14页 |
| ·国内、外研究开发Reteplase现状 | 第14-15页 |
| ·Reteplase的结构与功能及动物和临床实验 | 第15-17页 |
| ·Reteplase的分子结构 | 第15-16页 |
| ·体外Reteplase的功能 | 第16页 |
| ·动物模型中的试验 | 第16-17页 |
| ·t-PA与Reteplase临床药效学差异 | 第17页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第17-21页 |
| ·概述 | 第17-18页 |
| ·酵母表达宿主菌 | 第18页 |
| ·毕赤酵母表达载体 | 第18-19页 |
| ·影响外源基因在毕赤酵母中表达的重要因素 | 第19-21页 |
| ·外源基因特性 | 第19页 |
| ·表达框的染色体整合位点和方式 | 第19-20页 |
| ·基因剂量 | 第20页 |
| ·分泌信号 | 第20页 |
| ·产物稳定性 | 第20页 |
| ·表达产物的翻译后修饰 | 第20-21页 |
| ·毕赤酵母表达系统与大肠杆菌包涵体表达系统表达Reteplase比较分析 | 第21页 |
| ·本论文的研究工作 | 第21-23页 |
| 2.材料与方法 | 第23-30页 |
| ·菌种与质粒 | 第23页 |
| ·试剂与酶类 | 第23页 |
| ·试剂 | 第23页 |
| ·酶类 | 第23页 |
| ·培养基 | 第23-24页 |
| ·微生物学技术 | 第24页 |
| ·菌体的生长 | 第24页 |
| ·菌种的保存 | 第24页 |
| ·分子生物学方法 | 第24-30页 |
| ·大肠杆菌质粒的提取 | 第25页 |
| ·琼脂糖凝胶中DNA片断的回收 | 第25页 |
| ·DNA纯度和浓度的测定 | 第25页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第25页 |
| ·限制性内切酶 | 第25页 |
| ·大肠杆菌转化 | 第25页 |
| ·PCR反应 | 第25-26页 |
| ·DNA序列测定 | 第26页 |
| ·pPIC9K／rPA质粒的构建 | 第26页 |
| ·毕赤酵母细胞的转化 | 第26页 |
| ·阳性转化子的筛选 | 第26页 |
| ·阳性转化子的鉴定 | 第26-27页 |
| ·阳性转化子多拷贝筛选 | 第27页 |
| ·发酵条件的优化 | 第27页 |
| ·表达产物SDS-PAGE电泳检测 | 第27-29页 |
| ·试剂配制 | 第27-28页 |
| ·操作步骤 | 第28-29页 |
| ·表达产物Western blot鉴定 | 第29页 |
| ·表达产物生物学活性测定 | 第29-30页 |
| 3.结果 | 第30-39页 |
| ·目的基因的PCR扩增及鉴定 | 第30页 |
| ·pGEM-T／rPA测序载体的构建和鉴定 | 第30-31页 |
| ·pGEM-T／rPA序列分析 | 第31-33页 |
| ·pGEM-T／rPA质粒的构建和鉴定 | 第33-34页 |
| ·表达菌株的构建和筛选 | 第34-35页 |
| ·多拷贝转化子的筛选 | 第35页 |
| ·表达产物的鉴定 | 第35-36页 |
| ·SDS-PAGE鉴定 | 第35-36页 |
| ·Western blot鉴定 | 第36页 |
| ·生物学活性检测 | 第36-37页 |
| ·发酵条件的优化 | 第37-39页 |
| 4.讨论 | 第39-42页 |
| 全文总结 | 第42-43页 |
| 参考文献 | 第43-47页 |
| 致谢 | 第47页 |