| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-23页 |
| ·纤维素 | 第11-12页 |
| ·纤维素酶 | 第12-17页 |
| ·纤维素酶的分类及作用机制 | 第12-13页 |
| ·纤维素酶的分子结构 | 第13-14页 |
| ·纤维素酶的催化机制及理化性质 | 第14-16页 |
| ·纤维素酶的催化机制 | 第14-15页 |
| ·纤维素酶的理化性质 | 第15-16页 |
| ·纤维素酶的来源 | 第16-17页 |
| ·来源于微生物的纤维素酶 | 第16-17页 |
| ·来源于动物的纤维素酶 | 第17页 |
| ·纤维素酶的克隆与表达 | 第17-18页 |
| ·白蚁内源纤维素酶研究进展 | 第18页 |
| ·纤维素酶的分子进化 | 第18-19页 |
| ·酶分子进化策略 | 第18-19页 |
| ·纤维素酶分子进化研究进展 | 第19页 |
| ·本论文研究的意义 | 第19-22页 |
| ·研究白蚁纤维素酶的意义 | 第19-20页 |
| ·在大肠杆菌和酿酒酵母中表达纤维素酶的研究意义 | 第20-21页 |
| ·本论文研究的意义 | 第21-22页 |
| ·技术路线 | 第22-23页 |
| 第二章 材料与方法 | 第23-44页 |
| ·材料 | 第23-24页 |
| ·白蚁、菌株与质粒 | 第23页 |
| ·培养基 | 第23页 |
| ·酶与试剂 | 第23-24页 |
| ·主要仪器设备 | 第24页 |
| ·方法与步骤 | 第24-44页 |
| ·白蚁总RNA的提取以及cDNA的获得 | 第24-26页 |
| ·白蚁内切纤维素酶基因的鉴定 | 第26页 |
| ·引物设计及PCR扩增 | 第26-28页 |
| ·引物设计 | 第26-27页 |
| ·PCR扩增 | 第27-28页 |
| ·表达载体的构建 | 第28-31页 |
| ·目的基因大肠杆菌表达载体的构建 | 第28页 |
| ·目的基因酿酒酵母表达载体的构建 | 第28-31页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第31-32页 |
| ·大肠杆菌质粒DNA的大量制备(参考文献,略有修改) | 第32页 |
| ·大肠杆菌质粒DNA的小量制备(参考文献,略有修改) | 第32-33页 |
| ·酵母感受态的制备(参照文献,略有修改) | 第33页 |
| ·酿酒酵母质粒的提取 | 第33页 |
| ·DNA的酶切与连接 | 第33-34页 |
| ·连接产物化学转化大肠杆菌感受态细胞(参照文献) | 第34页 |
| ·质粒DNA化学转化酿酒酵母(采用LiAc/SS-DNA/PEG法) | 第34页 |
| ·阳性克隆的筛选和酶切验证 | 第34-35页 |
| ·外源片段在大肠杆菌中的诱导表达 | 第35-36页 |
| ·pSE380-EG转化子的刚果红染色 | 第35页 |
| ·转化子的诱导表达 | 第35页 |
| ·粗酶液的制备 | 第35-36页 |
| ·包涵体的检测 | 第36页 |
| ·外源基因在酵母中的诱导表达 | 第36-37页 |
| ·pYES2—EG转化子的刚果红染色 | 第36页 |
| ·酵母转化子的诱导表达 | 第36-37页 |
| ·表达产物的变性SDS-PAGE电泳 | 第37页 |
| ·酶的纯化 | 第37-38页 |
| ·蛋白含量测定 | 第38页 |
| ·酶活的测定 | 第38-41页 |
| ·酶活的测定原理 | 第38-39页 |
| ·酶活测定步骤 | 第39页 |
| ·葡萄糖标准曲线的测定 | 第39-40页 |
| ·酶活定义 | 第40页 |
| ·酶活力计算 | 第40-41页 |
| ·白蚁内切纤维素酶酶学性质测定 | 第41页 |
| ·白蚁内切纤维素酶分子理性设计试验方法 | 第41-44页 |
| ·饱和突变点的选择 | 第41页 |
| ·饱和突变方法—一步反向PCR法 | 第41-42页 |
| ·白蚁内切纤维素酶基因饱和突变PCR引物设计 | 第42页 |
| ·饱和突变的PCR扩增 | 第42-43页 |
| ·白蚁内切纤维素酶基因饱和突变文库的构建与筛选 | 第43页 |
| ·饱和突变酶的基因测序及序列分析 | 第43页 |
| ·饱和突变酶的酶学性质测定 | 第43-44页 |
| 第三章 结果和分析 | 第44-58页 |
| ·白蚁内切纤维素酶基因的鉴定 | 第44-45页 |
| ·白蚁内切纤维素酶基因的获得与测序 | 第44页 |
| ·白蚁内切纤维素酶基因的序列分析 | 第44-45页 |
| ·白蚁内切纤维素酶在大肠杆菌中的表达 | 第45-50页 |
| ·白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶基因(EG)与表达载体pSE380的连接 | 第45-46页 |
| ·转化子的平板筛选 | 第46-47页 |
| ·白蚁内切纤维素酶基因的表达、纯化及SDS-PAGE电泳 | 第47-48页 |
| ·白蚁内切纤维素酶酶学性质的研究 | 第48-50页 |
| ·温度和pH值对白蚁内切纤维素酶酶活的影响 | 第48-50页 |
| ·Km值及Vmax的测定 | 第50页 |
| ·白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母中的表达 | 第50-52页 |
| ·转化子的平板筛选 | 第51页 |
| ·酿酒酵母转化子诱导时间的确定 | 第51-52页 |
| ·白蚁内切纤维素酶的分子改性 | 第52-58页 |
| ·白蚁内切纤维素酶基因突变位点的选择 | 第52-53页 |
| ·白蚁内切纤维素酶基因定点突变PCR | 第53页 |
| ·突变体的获得及序列分析 | 第53-54页 |
| ·突变型EG的纯化及SDS-PAGE分析 | 第54页 |
| ·野生酶及突变酶的酶学性质比较 | 第54-58页 |
| ·最适温度和最适pH的比较 | 第54-56页 |
| ·Km值、Vmax及比活力的比较 | 第56-58页 |
| 第四章 讨论 | 第58-60页 |
| ·重组质粒pYES2-EG在酿酒酵母中表达CMCase活力低的原因 | 第58页 |
| ·白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶基因的定点突变 | 第58-60页 |
| ·突变点的确定 | 第58-59页 |
| ·突变点的分析 | 第59-60页 |
| 第五章 结论与展望 | 第60-62页 |
| ·结论 | 第60-61页 |
| ·问题与展望 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-69页 |
| 附录 | 第69-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第78页 |
