| 中文摘要 | 第21-24页 |
| ABSTRACT | 第24-27页 |
| 第一章 文献综述 | 第28-48页 |
| 1 引言 | 第28页 |
| 2 肿瘤微环境与肿瘤相关巨噬细胞 | 第28-37页 |
| 2.1 肿瘤微环境的组成 | 第28-30页 |
| 2.2 肿瘤相关巨噬细胞的起源 | 第30-31页 |
| 2.3 肿瘤相关巨噬细胞的极化类型受肿瘤微环境调控 | 第31-34页 |
| 2.4 肿瘤相关巨噬细胞对微环境的改造 | 第34-36页 |
| 2.5 肿瘤相关巨噬细胞研究中存在的问题及展望 | 第36-37页 |
| 3 肿瘤细胞与GRP78 | 第37-45页 |
| 3.1 GRP78的基本结构和功能 | 第37-38页 |
| 3.2 GRP78对肿瘤细胞的影响 | 第38-41页 |
| 3.2.1 细胞核中的GRP78 | 第38-39页 |
| 3.2.2 线粒体中的GRP78 | 第39-40页 |
| 3.2.3 胞浆中的GRP78 | 第40页 |
| 3.2.4 细胞膜表面的GRP78 | 第40-41页 |
| 3.3 细胞分泌型GRP78对肿瘤微环境的影响 | 第41-42页 |
| 3.4 靶向GRP78的肿瘤干预策略 | 第42-45页 |
| 4 本课题的研究意义及研究内容 | 第45-48页 |
| 第二章 M2型巨噬细胞通过诱导肿瘤细胞GRP78高表达而促进其迁移 | 第48-84页 |
| 1 引言 | 第48页 |
| 2 材料与方法 | 第48-63页 |
| 2.1 实验材料、仪器及试剂 | 第48-54页 |
| 2.1.1 细胞系和质粒 | 第48页 |
| 2.1.2 试剂及抗体 | 第48-50页 |
| 2.1.3 试剂配方 | 第50-53页 |
| 2.1.4 实验仪器 | 第53-54页 |
| 2.2 细胞培养以及巨噬细胞的诱导极化 | 第54-56页 |
| 2.2.1 人外周血单核细胞分离 | 第54页 |
| 2.2.2 单核细胞诱导极化 | 第54-55页 |
| 2.2.3 细胞培养 | 第55-56页 |
| 2.2.4 巨噬细胞培养基的收集 | 第56页 |
| 2.3 ELISA检测 | 第56页 |
| 2.4 GRP78 shRNA干扰质粒构建 | 第56-57页 |
| 2.5 细胞转染 | 第57-58页 |
| 2.5.1 质粒转染 | 第57页 |
| 2.5.2 siRNA转染 | 第57-58页 |
| 2.6 Transwell细胞迁移和浸润实验 | 第58页 |
| 2.7 MTT细胞活性实验 | 第58页 |
| 2.8 Western blot实验 | 第58-59页 |
| 2.9 荧光定量PCR实验 | 第59-62页 |
| 2.9.1 细胞总RNA的提取 | 第59-60页 |
| 2.9.2 细胞总RNA的反转录 | 第60-61页 |
| 2.9.3 荧光定量PCR | 第61-62页 |
| 2.10 流式细胞术检测巨噬细胞分型 | 第62页 |
| 2.11 免疫荧光检测细胞中钙离子变化情况 | 第62页 |
| 2.12 细胞内钙离子浓度和ATP浓度检测 | 第62页 |
| 2.13 数据统计与分析 | 第62-63页 |
| 3 实验结果 | 第63-81页 |
| 3.1 体外诱导人单核细胞分化为M1型和M2型巨噬细胞 | 第63-66页 |
| 3.2 20%的M2型巨噬细胞培养基能够诱导肿瘤细胞迁移 | 第66-68页 |
| 3.3 20%的M2型巨噬细胞培养基可以诱导肿瘤细胞中GRP78高表达 | 第68-69页 |
| 3.4 GRP78在M2型巨噬细胞诱导的肿瘤细胞迁移过程中发挥了重要作用 | 第69-71页 |
| 3.5 M2型巨噬细胞特异性分泌的CCL17和CCL22是肿瘤细胞中GRP78高表达的主要诱因 | 第71-74页 |
| 3.6 阻断CCL17/CCL22-CCR4信号可以抑制M2-MCM对肿瘤细胞GRP78的诱导 | 第74-75页 |
| 3.7 CCL17/CCL22-CCR4信号促进了肿瘤细胞内钙离子聚集以及ATF6的激活 | 第75-77页 |
| 3.8 CCL17/CCL22-CCR4信号能够通过PI3K/Akt信号抑制内质网钙离子通道蛋白IP3R的活性 | 第77-79页 |
| 3.9 抑制PI3K/Akt信号或激活IP3R可以缓解M2-MCM造成的钙离子聚集 | 第79-80页 |
| 3.10 激活IP3R可以抑制M2-MCM诱导的肿瘤细胞迁移 | 第80-81页 |
| 4 讨论 | 第81-83页 |
| 5 小结 | 第83-84页 |
| 第三章 高表达的GRP78通过激活肿瘤细胞自身炎症反应促进其迁移 | 第84-110页 |
| 1 引言 | 第84页 |
| 2 材料与方法 | 第84-94页 |
| 2.1 实验材料、仪器及试剂 | 第84-87页 |
| 2.1.1 细胞系和质粒 | 第84-85页 |
| 2.1.2 裸鼠和人组织标本 | 第85页 |
| 2.1.3 试剂及抗体 | 第85页 |
| 2.1.4 试剂配方 | 第85-87页 |
| 2.1.5 实验仪器 | 第87页 |
| 2.2 细胞培养 | 第87页 |
| 2.3 Western blot和荧光定量PCR | 第87-88页 |
| 2.4 GRP78真核表达质粒及其截短和突变质粒的构建 | 第88-90页 |
| 2.4.1 GRP78真核表达质粒的构建 | 第88-89页 |
| 2.4.2 GRP78截短体真核表达质粒的构建 | 第89页 |
| 2.4.3 GRP78突变体的真核质粒构建 | 第89-90页 |
| 2.5 GST和GST-GRP78蛋白的诱导表达和纯化 | 第90-91页 |
| 2.6 GST pulldown实验 | 第91页 |
| 2.7 免疫共沉淀实验 | 第91-92页 |
| 2.8 免疫荧光染色 | 第92页 |
| 2.9 稳定敲除GRP78的DLD1细胞株构建 | 第92-93页 |
| 2.10 小鼠肿瘤浸润实验 | 第93页 |
| 2.11 HE染色和免疫组化实验 | 第93-94页 |
| 2.11.1 动物组织HE染色 | 第93页 |
| 2.11.2 免疫组化检测 | 第93-94页 |
| 2.12 数据统计与分析 | 第94页 |
| 3 实验结果 | 第94-108页 |
| 3.1 M2型巨噬细胞的条件培养基能够激活肿瘤细胞的炎症反应 | 第94-95页 |
| 3.2 IL-1β和TNF-α在M2-MCM诱导的肿瘤细胞迁移过程中发挥了关键作用 | 第95-97页 |
| 3.3 GRP78介导了M2-MCM对肿瘤细胞的炎症诱导 | 第97-98页 |
| 3.4 GRP78促进了STAT3的磷酸化以及入核 | 第98-101页 |
| 3.5 GRP78与STAT3存在相互作用 | 第101-102页 |
| 3.6 GRP78的底物结合结构域介导了GRP78与STAT3的相互作用 | 第102-103页 |
| 3.7 GRP78的底物结合活性促进了STAT3的磷酸化 | 第103-104页 |
| 3.8 JAK2介导了GRP78对STAT3的磷酸化作用 | 第104-105页 |
| 3.9 GRP78在M2型巨噬细胞诱导的小鼠肿瘤浸润过程中发挥了关键作用 | 第105-106页 |
| 3.10 临床样本中GRP78的表达与M2型巨噬细胞的浸润以及STAT3的磷酸化呈正相关 | 第106-108页 |
| 4 讨论 | 第108-109页 |
| 5 小结 | 第109-110页 |
| 第四章 高表达的GRP78能够通过调节粘附以及上皮间质转化促进肿瘤细胞迁移 | 第110-128页 |
| 1 引言 | 第110页 |
| 2 材料与方法 | 第110-113页 |
| 2.1 实验材料、仪器及试剂 | 第110-111页 |
| 2.1.1 细胞系和质粒 | 第110页 |
| 2.1.2 试剂和抗体 | 第110-111页 |
| 2.1.3 实验仪器 | 第111页 |
| 2.2 细胞培养 | 第111页 |
| 2.3 稳定过表达GRP78的DLD1细胞株构建 | 第111页 |
| 2.4 细胞粘附实验 | 第111-112页 |
| 2.4.1 细胞与基质之间的粘附 | 第111页 |
| 2.4.2 细胞之间的粘附 | 第111-112页 |
| 2.5 细胞划痕实验 | 第112页 |
| 2.6 免疫荧光染色 | 第112页 |
| 2.7 Western blot和qRT-PCR实验 | 第112-113页 |
| 2.8 数据统计与分析 | 第113页 |
| 3 实验结果 | 第113-124页 |
| 3.1 高表达的GRP78能够促进肿瘤细胞迁移 | 第113-114页 |
| 3.2 高表达的GRP78能够促进肿瘤细胞与基质的粘附 | 第114-115页 |
| 3.3 Fibronectin-integrin-β1-FAK信号介导了GRP78的促粘附作用 | 第115-118页 |
| 3.4 高表达的GRP78激活了肿瘤细胞的上皮间质转化 | 第118-120页 |
| 3.5 Snail-2参与了GRP78对肿瘤细胞上皮间质转化的调控 | 第120-121页 |
| 3.6 TGF-β信号参与了GRP78对粘附以及上皮间质转化的调控 | 第121-123页 |
| 3.7 高表达的GRP78通过激活TGF-β/Smad2/3 信号促进肿瘤细胞迁移 | 第123-124页 |
| 4 讨论 | 第124-125页 |
| 5 小结 | 第125-128页 |
| 第五章 肿瘤细胞分泌的GRP78促进了巨噬细胞的M2型极化 | 第128-142页 |
| 1 引言 | 第128页 |
| 2 材料与方法 | 第128-131页 |
| 2.1 实验材料、仪器及试剂 | 第128-129页 |
| 2.1.1 细胞系和质粒 | 第128页 |
| 2.1.2 试剂及抗体 | 第128-129页 |
| 2.1.3 溶液配制 | 第129页 |
| 2.1.4 实验仪器 | 第129页 |
| 2.2 细胞培养 | 第129页 |
| 2.3 细胞培养基中GRP78的去除 | 第129-130页 |
| 2.4 His-GRP78的表达纯化以及内毒素的去除 | 第130页 |
| 2.5 氢核磁共振（~1H NMR）代谢组学备样 | 第130-131页 |
| 2.6 ~1H NMR测试条件及数据处理 | 第131页 |
| 2.7 Western blot和荧光定量PCR | 第131页 |
| 2.8 数据统计与分析 | 第131页 |
| 3 实验结果 | 第131-139页 |
| 3.1 肿瘤细胞分泌的GRP78参与了巨噬细胞的极化过程 | 第131-133页 |
| 3.2 纯化的GRP78能够诱导巨噬细胞极化 | 第133-134页 |
| 3.3 纯化的GRP78能够诱导RAW264.7细胞中M2型巨噬细胞标志物的表达 | 第134-135页 |
| 3.4 纯化的GRP78影响巨噬细胞代谢产物的核磁图谱指认 | 第135-137页 |
| 3.5 GRP78处理前后巨噬细胞中代谢产物的多元统计分析 | 第137-138页 |
| 3.6 GRP78诱导RAW264.7细胞向M2型巨噬细胞极化 | 第138-139页 |
| 4 讨论 | 第139-141页 |
| 5 小结 | 第141-142页 |
| 第六章 靶向肿瘤细胞GRP78的重组亚麻酶胞毒素的表达、纯化以及肿瘤靶向效应评估 | 第142-162页 |
| 1 引言 | 第142页 |
| 2 材料与方法 | 第142-148页 |
| 2.1 实验材料、仪器及试剂 | 第142-145页 |
| 2.1.1 细胞系、菌株和质粒 | 第142-143页 |
| 2.1.2 试剂及抗体 | 第143页 |
| 2.1.3 溶液配制 | 第143-145页 |
| 2.1.4 实验仪器 | 第145页 |
| 2.2 细胞培养 | 第145页 |
| 2.3 质粒构建 | 第145-146页 |
| 2.4 GBP-SubA蛋白诱导表达 | 第146页 |
| 2.5 GBP-SubA蛋白纯化 | 第146-147页 |
| 2.6 流式细胞术检测细胞表面GRP78 | 第147页 |
| 2.7 细胞增殖实验 | 第147-148页 |
| 2.7.1 MTT法 | 第147页 |
| 2.7.2 细胞计数法 | 第147-148页 |
| 2.8 流式检测细胞凋亡 | 第148页 |
| 2.9 TUNEL检测细胞凋亡 | 第148页 |
| 2.10 免疫荧光染色 | 第148页 |
| 2.11 Western blot实验 | 第148页 |
| 2.12 数据统计与分析 | 第148页 |
| 3 实验结果 | 第148-158页 |
| 3.1 重组质粒的构建 | 第148-150页 |
| 3.2 GBP-SubA蛋白表达条件的优化 | 第150-152页 |
| 3.3 GBP-SubA蛋白的纯化 | 第152-153页 |
| 3.4 用于检测GBP-SubA活性的细胞模型筛选 | 第153-154页 |
| 3.5 重组蛋白GBP-SubA的活性检测 | 第154-155页 |
| 3.6 重组的GBP-SubA蛋白能够抑制肿瘤细胞的生长 | 第155-157页 |
| 3.7 封堵细胞表面的GRP78能够阻断GBP-SubA的凋亡诱导作用 | 第157-158页 |
| 4 讨论 | 第158-160页 |
| 5 小结 | 第160-162页 |
| 总结与展望 | 第162-164页 |
| 参考文献 | 第164-184页 |
| 缩略词表 | 第184-186页 |
| 研究成果 | 第186-188页 |
| 致谢 | 第188-190页 |
| 个人简况及联系方式 | 第190页 |
