| 摘要 | 第17-18页 |
| ABSTRACT | 第18页 |
| 第一章 前言 | 第19-40页 |
| 1.1 缺氧 | 第19页 |
| 1.2 与缺氧有关的信号通路 | 第19页 |
| 1.3 缺氧诱导因子HIF | 第19-26页 |
| 1.3.1 HIF的发现 | 第19-20页 |
| 1.3.2 HIF的家族成员和结构 | 第20-21页 |
| 1.3.3 HIF的下游调控基因 | 第21-23页 |
| 1.3.4 HIF与细胞增殖、死亡 | 第23页 |
| 1.3.5 HIF与发育(HIF的小鼠模型) | 第23页 |
| 1.3.6 HIF与肿瘤 | 第23-24页 |
| 1.3.7 HIF的调控 | 第24-25页 |
| 1.3.8 HIF与其它信号通路的交互作用 | 第25页 |
| 1.3.9 HIF与VHL疾病(VHL disease) | 第25-26页 |
| 1.4 HIF信号通路的生物学功能 | 第26-29页 |
| 1.4.1 HIF信号通路在哺乳动物胚胎发育过程中的重要作用 | 第26-27页 |
| 1.4.2 HIF信号通路在炎症反应中的重要作用 | 第27页 |
| 1.4.3 HIF信号通路在肿瘤发生和发展过程中的重要作用 | 第27-29页 |
| 1.4.3.1 HIF信号通路与细胞代谢重塑 | 第27-28页 |
| 1.4.3.2 HIF信号通路与血管生成 | 第28页 |
| 1.4.3.3 HIF信号通路与肿瘤干细胞维持 | 第28页 |
| 1.4.3.4 HIF信号通路与肿瘤转移、侵袭 | 第28-29页 |
| 1.4.3.5 HIF信号通路与肿瘤放射性治疗 | 第29页 |
| 1.5 HIF脯氨酸羟基化酶(HIF-prolyl hydroxylase,HPH) | 第29-34页 |
| 1.5.1 HPH的家族成员和保守性 | 第29-30页 |
| 1.5.2 PHDs与HIF | 第30-32页 |
| 1.5.3 PHDs的其它功能 | 第32页 |
| 1.5.4 PHDs与肿瘤 | 第32-33页 |
| 1.5.5 PHDs活性的调控 | 第33-34页 |
| 1.5.5.1 氧气浓度 | 第33页 |
| 1.5.5.2 细胞内亚铁离子浓度 | 第33-34页 |
| 1.5.5.3 2-OG类似物的竞争抑制作用 | 第34页 |
| 1.5.5.4 PHDs的转录和蛋白稳定性 | 第34页 |
| 1.6 RHOBTB3 | 第34-38页 |
| 1.6.1 RHOBTB的家族成员和结构 | 第34-35页 |
| 1.6.2 RHOBTB3的组织分布 | 第35-36页 |
| 1.6.3 RHOBTB3的功能 | 第36-38页 |
| 1.6.4 RHOBTB3与肿瘤 | 第38页 |
| 1.7 研究背景、内容及意义 | 第38-40页 |
| 1.7.1 研究背景 | 第38页 |
| 1.7.2 研究内容 | 第38-39页 |
| 1.7.3 研究意义 | 第39-40页 |
| 第二章 材料和方法 | 第40-66页 |
| 2.1 常用药品和试剂 | 第40-41页 |
| 2.2 实验仪器 | 第41页 |
| 2.3 DNA相关实验方法 | 第41-56页 |
| 2.3.1 质粒载体 | 第41-48页 |
| 2.3.1.1 pBluescript SK(-) | 第41-42页 |
| 2.3.1.2 pCMV5 | 第42-43页 |
| 2.3.1.3 pcDNA3.3 | 第43-44页 |
| 2.3.1.4 pGEX | 第44页 |
| 2.3.1.5 pET-28a | 第44-45页 |
| 2.3.1.6 pBOBI | 第45-46页 |
| 2.3.1.7 pLL3.7 | 第46-47页 |
| 2.3.1.8 pGL3-Basic | 第47-48页 |
| 2.3.2 大肠杆菌感受态细胞的制备和DNA转化 | 第48-49页 |
| 2.3.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第48-49页 |
| 2.3.2.2 DNA转化 | 第49页 |
| 2.3.3 质粒DNA的提取 | 第49-52页 |
| 2.3.3.1 小规模质粒DNA的提取(STET煮沸法) | 第49-50页 |
| 2.3.3.2 中等规模质粒DNA的提取(碱变性法) | 第50页 |
| 2.3.3.3 大规模质粒DNA的提取(CsCl超速离心法) | 第50-52页 |
| 2.3.4 质粒DNA的工具酶处理 | 第52-53页 |
| 2.3.4.1 DNA的限制性内切酶消化 | 第52页 |
| 2.3.4.2 线性DNA末端平滑化 | 第52页 |
| 2.3.4.3 线性DNA 5'端磷酸化 | 第52页 |
| 2.3.4.4 线性DNA 5'端磷酸基团的去除 | 第52-53页 |
| 2.3.5 DNA片段的纯化 | 第53-54页 |
| 2.3.5.1 琼脂糖电泳分离DNA | 第53页 |
| 2.3.5.2 琼脂糖凝胶中DNA的回收 | 第53-54页 |
| 2.3.5.3 从溶液中回收DNA | 第54页 |
| 2.3.6 DNA连接反应 | 第54页 |
| 2.3.7 LIC | 第54-55页 |
| 2.3.8 PCR相关实验 | 第55页 |
| 2.3.8.1 PCR反应 | 第55页 |
| 2.3.8.2 PCR产物的克隆 | 第55页 |
| 2.3.8.3 荧光定量RT-PCR | 第55页 |
| 2.3.9 哺乳动物细胞表达质粒的构建 | 第55-56页 |
| 2.3.10 原核表达质粒的构建 | 第56页 |
| 2.3.11 RNA干扰表达质粒的构建 | 第56页 |
| 2.4 蛋白质相关实验方法 | 第56-61页 |
| 2.4.1 蛋白质的表达和纯化 | 第56-57页 |
| 2.4.1.1 GST融合蛋白的表达和纯化 | 第56-57页 |
| 2.4.1.2 HIS融合蛋白的表达和纯化 | 第57页 |
| 2.4.2 免疫共沉淀 | 第57-59页 |
| 2.4.3 两步法免疫共沉淀 | 第59页 |
| 2.4.4 蛋白质的SDS-PAGE电泳与western blot分析 | 第59-60页 |
| 2.4.5 蛋白体外羟基化实验 | 第60-61页 |
| 2.5 细胞相关实验 | 第61-64页 |
| 2.5.1 细胞培养 | 第61-62页 |
| 2.5.1.1 细胞培养液的配制 | 第61页 |
| 2.5.1.2 小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养 | 第61-62页 |
| 2.5.1.3 细胞的传代和接种 | 第62页 |
| 2.5.2 瞬时转染 | 第62-63页 |
| 2.5.2.1 Lipofectamine 2000转染 | 第62页 |
| 2.5.2.2 PEI转染 | 第62-63页 |
| 2.5.2.3 磷酸钙转染 | 第63页 |
| 2.5.3 慢病毒感染 | 第63页 |
| 2.5.4 荧光素酶报告基因实验 | 第63-64页 |
| 2.6 裸鼠肿瘤移植实验 | 第64页 |
| 2.7 组织切片 | 第64-65页 |
| 2.7.1 裸鼠移植瘤石蜡切片 | 第64-65页 |
| 2.7.2 新生小鼠肾脏冰冻切片 | 第65页 |
| 2.8 石蜡切片的免疫荧光染色 | 第65页 |
| 2.9 冰冻切片的苏木精-伊红(HE)染色 | 第65-66页 |
| 第三章 结果 | 第66-97页 |
| 3.1 RHOBTB3是一个肿瘤抑制因子 | 第66-69页 |
| 3.1.1 Oncomine数据库提供证据 | 第66页 |
| 3.1.2 裸鼠肿瘤移植实验证实RHOBTB3是肿瘤抑制因子 | 第66-69页 |
| 3.2 RHOBTB3抑制缺氧诱导的HIF信号通路激活 | 第69-76页 |
| 3.2.1 对MEF细胞移植瘤的western blot和免疫荧光染色分析 | 第69-71页 |
| 3.2.2 对HeLa细胞移植瘤的荧光定量RT-PCR分析 | 第71-72页 |
| 3.2.3 对人肾细胞癌样品的western blot和荧光定量RT-PCR分析 | 第72-74页 |
| 3.2.4 原代Rhobtb3~(-/-)和野生型MEF细胞的荧光定量RT-PCR和western blot分析 | 第74-75页 |
| 3.2.5 RHOBTB3抑制HIF1的转录活性 | 第75-76页 |
| 3.3 RHOBTB3下调HIF-1α的蛋白水平 | 第76-80页 |
| 3.3.1 过量表达RHOBTB3促进HIF1A的降解 | 第77-78页 |
| 3.3.2 Rhobtb3基因敲除导致Hif1α蛋白水平上调 | 第78-79页 |
| 3.3.3 调控HIF-1α蛋白水平的功能是RHOBTB3特异性的 | 第79-80页 |
| 3.4 RHOBTB3促进HIF-1α的脯氨酸羟基化修饰水平导致其降解 | 第80-84页 |
| 3.4.1 RHOBTB3影响HIF1A的脯氨酸羟基化水平 | 第80-82页 |
| 3.4.2 RHOBTB3通过泛素-蛋白酶体途径实现对HIF-1α蛋白的降解 | 第82-83页 |
| 3.4.3 RHOBTB3促进原核表达HIF1A肽段的羟基化水平 | 第83-84页 |
| 3.5 RHOBTB3促进EGLN1对HIF-1α的脯氨酸羟基化修饰 | 第84-88页 |
| 3.5.1 RHOBTB3与EGLN1能够相互作用 | 第84-86页 |
| 3.5.2 缺氧刺激削弱RHOBTB3和EGLN1的相互作用 | 第86-87页 |
| 3.5.3 RHOBTB3对HIF-1α的降解依赖于EGLN1 | 第87-88页 |
| 3.6 RHOBTB3 ATPase活性是降解HIF-1α所必需的 | 第88-92页 |
| 3.6.1 RHOBTB3 N138D突变体不影响HIF1A的蛋白水平 | 第88-90页 |
| 3.6.2 RHOBTB3 N138D突变体不影响HIF1的转录活性 | 第90-91页 |
| 3.6.3 RHOBTB3 N138D突变体不影响原核表达HIF1A肽段的脯氨酸羟基化水平 | 第91页 |
| 3.6.4 RHOBTB3 N138D突变体与EGLN1具有很弱的相互作用 | 第91-92页 |
| 3.7 对Rhobb3~(-/-)小鼠的初步研究 | 第92-96页 |
| 3.7.1 Rhobtb3~(-/-)小鼠的新生儿致死表型 | 第92-94页 |
| 3.7.2 Rhobtb3~(-/-)新生小鼠体长异常 | 第94-95页 |
| 3.7.3 Rhobtb3~(-/-)小鼠肾脏发生肾小管坏死 | 第95-96页 |
| 3.8 小结 | 第96-97页 |
| 第四章 讨论 | 第97-102页 |
| 参考文献 | 第102-123页 |
| 附录一: 图表索引 | 第123-126页 |
| 附表1: 人源基因荧光定量RT-PCR引物和扩增方案 | 第126-127页 |
| 附表2: 鼠源基因荧光定量RT-PCR引物和扩增方案 | 第127-128页 |
| 致谢 | 第128页 |
