| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩略词表 | 第17-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-29页 |
| 1.1 三七的研究概况 | 第18-19页 |
| 1.1.1 三七皂苷的生物合成 | 第18-19页 |
| 1.2 植物次生代谢途径的研究 | 第19-20页 |
| 1.3 植物转录因子 | 第20-24页 |
| 1.3.1 植物转录因子的结构特点与功能 | 第20-21页 |
| 1.3.2 转录因子的活性 | 第21-22页 |
| 1.3.3 与植物次生代谢相关转录因子的分离与鉴定 | 第22页 |
| 1.3.4 调控植物次生代谢途径相关的转录因子研究 | 第22-24页 |
| 1.4 AP2/ERF类转录因子 | 第24-26页 |
| 1.4.1 AP2/ERF转录因子的结构特点 | 第24页 |
| 1.4.2 AP2/ERF转录因子的功能特征 | 第24-26页 |
| 1.5 转录因子在萜类合成代谢方面的应用前景 | 第26页 |
| 1.6 本课题的研究目的和意义 | 第26-28页 |
| 1.7 技术路线 | 第28-29页 |
| 第二章 三七皂苷合成相关PnER转录因子基因的克隆 | 第29-43页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第29-30页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第29页 |
| 2.1.2 菌株和载体 | 第29页 |
| 2.1.3 酶与试剂盒 | 第29-30页 |
| 2.1.4 引物 | 第30页 |
| 2.2 试剂和培养基 | 第30页 |
| 2.3 cDNA文库的构建 | 第30-35页 |
| 2.3.1 三七细胞总RNA的抽提 | 第30-31页 |
| 2.3.2 三七poly(A) RNA的纯化 | 第31-32页 |
| 2.3.3 RACE-Ready cDNA的制备 | 第32-33页 |
| 2.3.4 PnERF基因的5'-RACE方法 | 第33页 |
| 2.3.5 DNA片段回收、连接和转化 | 第33-34页 |
| 2.3.6 PnERF基因的3'-RACE方法 | 第34-35页 |
| 2.3.7 PnERF基因全长cDNA的克隆 | 第35页 |
| 2.3.8 生物信息学分析 | 第35页 |
| 2.4 结果与分析 | 第35-41页 |
| 2.4.1 三七细胞总RNA的抽提及mRNA的分离 | 第35-36页 |
| 2.4.2 PnERF全长cDNA的获得和分析 | 第36-37页 |
| 2.4.3 PnERF编码区编码蛋白的序列性质分析 | 第37页 |
| 2.4.4 PnERF多重序列比对和系统进化分析 | 第37-41页 |
| 2.4.5 PnERF编码蛋白质的二级结构及三维结构预测分析 | 第41页 |
| 2.5 小结 | 第41-43页 |
| 第三章 三七皂苷生物合成关键酶基因启动子的克隆与活性分析 | 第43-62页 |
| 3.1 材料和试剂 | 第43-45页 |
| 3.1.1 植物材料 | 第43页 |
| 3.1.2 菌株和载体 | 第43页 |
| 3.1.3 试剂 | 第43-44页 |
| 3.1.4 引物 | 第44页 |
| 3.1.5 缓冲液和培养基 | 第44-45页 |
| 3.2. 实验方法 | 第45-53页 |
| 3.2.1 SE、DS和SS启动子的克隆及序列分析 | 第45-49页 |
| 3.2.2 启动子植物表达载体的构建 | 第49-51页 |
| 3.2.3 农杆菌介导转化烟草 | 第51-52页 |
| 3.2.4 GUS活性的检测 | 第52-53页 |
| 3.3 结果与分析 | 第53-60页 |
| 3.3.1 SE基因组DNA全长序列的克隆和序列分析 | 第53-54页 |
| 3.3.2 SE、DS和SS基因启动子的克隆 | 第54-55页 |
| 3.3.3 SE、DS和SS基因启动子调控序列分析 | 第55-56页 |
| 3.3.4 启动子片段融合GUS植物表达载体的构建 | 第56-57页 |
| 3.3.5 关键酶基因启动子的瞬时表达分析 | 第57-58页 |
| 3.3.6 蛋白标准曲线的制作 | 第58-59页 |
| 3.3.7 GUS荧光标准曲线的制作 | 第59页 |
| 3.3.8 启动子的表达活性分析 | 第59-60页 |
| 3.4 小结 | 第60-62页 |
| 第四章 PnERF转录因子的功能分析 | 第62-79页 |
| 4.1 材料和试剂 | 第62-65页 |
| 4.1.1 植物材料 | 第62页 |
| 4.1.2 菌株和载体 | 第62页 |
| 4.1.3 试剂 | 第62-65页 |
| 4.2 方法 | 第65-71页 |
| 4.2.1 原核表达载体的构建 | 第65-66页 |
| 4.2.2 原核表达菌株感受态细胞的制备及转化 | 第66页 |
| 4.2.3 His-PnERF融合蛋白的诱导表达与纯化 | 第66-68页 |
| 4.2.4 外源蛋白的浓缩 | 第68-69页 |
| 4.2.5 凝胶阻滞实验(EMSA) | 第69-71页 |
| 4.3 结果和分析 | 第71-78页 |
| 4.3.1 PnERF基因的原核表达的构建及蛋白纯化 | 第71-75页 |
| 4.3.2 PnERF与顺式作用元件的凝胶阻滞结果 | 第75-77页 |
| 4.3.3 PnERF与三七皂苷合成途径中SE、DS和SS启动子区的结合 | 第77-78页 |
| 4.4 小结 | 第78-79页 |
| 第五章 根癌农杆菌介导PnERF转录因子遗传转化研究 | 第79-98页 |
| 5.1 材料和试剂 | 第79-81页 |
| 5.1.1 植物材料 | 第79页 |
| 5.1.2 菌株和载体 | 第79页 |
| 5.1.3 试剂 | 第79-80页 |
| 5.1.4 缓冲液和培养基 | 第80页 |
| 5.1.5 引物 | 第80-81页 |
| 5.2 实验方法 | 第81-86页 |
| 5.2.1 PnERF基因植物表达载体的构建 | 第81页 |
| 5.2.2 农杆菌介导的遗传转化 | 第81-82页 |
| 5.2.3 转基因三七细胞分子水平的筛选 | 第82-84页 |
| 5.2.4 转基因三七细胞皂苷含量检测 | 第84-86页 |
| 5.3 结果与分析 | 第86-95页 |
| 5.3.1 pCAMBIA1300-PnERF植物表达载体的构建及工程菌的制备 | 第86-88页 |
| 5.3.2 转基因三七细胞株系的普通PCR检测 | 第88-89页 |
| 5.3.3 转基因三七细胞株系转录水平的检测 | 第89-93页 |
| 5.3.4 三七总皂苷含量的检测 | 第93-94页 |
| 5.3.5 单体皂苷含量的检测 | 第94-95页 |
| 5.4 小结 | 第95-98页 |
| 第六章 结论与展望 | 第98-101页 |
| 6.1 研究总结 | 第98-99页 |
| 6.2 展望 | 第99-101页 |
| 致谢 | 第101-102页 |
| 参考文献 | 第102-111页 |
| 附录A 载体图谱 | 第111-113页 |
| 附录B 攻读硕士期间发表的论文目录 | 第113页 |
