| 摘要 | 第4-5页 |
| abstract | 第5页 |
| 引言 | 第13-25页 |
| 0.1 甘露糖简介 | 第13页 |
| 0.2 甘露糖应用 | 第13-14页 |
| 0.3 甘露糖制备方法 | 第14-16页 |
| 0.3.1 甘露糖化学法制备 | 第14-15页 |
| 0.3.2 甘露糖酶法制备 | 第15页 |
| 0.3.3 化学法与酶法联合制备 | 第15-16页 |
| 0.4 烟酰胺型辅酶循环体系研究 | 第16-18页 |
| 0.4.1 NAD+与NADH循环 | 第16-17页 |
| 0.4.2 NADP+与NADPH循环 | 第17-18页 |
| 0.5 多酶催化体系 | 第18-23页 |
| 0.5.1 稀有糖醛转化 | 第19页 |
| 0.5.2 手性异构体的合成 | 第19-20页 |
| 0.5.3 多酶级联与其他物理化学方法联用 | 第20页 |
| 0.5.4 多酶催化反应生成甘露糖研究 | 第20-23页 |
| 0.6 研究的目的与意义 | 第23-24页 |
| 0.7 研究内容及技术路线 | 第24-25页 |
| 第1章 关键酶的筛选与制备 | 第25-39页 |
| 1.1 关键酶基因信息的筛选 | 第25-31页 |
| 1.1.1 菌株 | 第25页 |
| 1.1.2 引物 | 第25-26页 |
| 1.1.3 质粒 | 第26-27页 |
| 1.1.4 培养基 | 第27页 |
| 1.1.5 主要试剂 | 第27-30页 |
| 1.1.5.1 分子克隆相关试剂 | 第27页 |
| 1.1.5.2 DNA电泳相关试剂 | 第27-28页 |
| 1.1.5.3 蛋白电泳相关试剂 | 第28-29页 |
| 1.1.5.4 其他试剂与药品 | 第29-30页 |
| 1.1.6 实验仪器 | 第30-31页 |
| 1.2 实验方法 | 第31-33页 |
| 1.2.1 甘露醇-2-脱氢酶基因MDH的克隆与表达载体的构建 | 第31-33页 |
| 1.2.1.1 引物设计及目的基因的扩增 | 第31页 |
| 1.2.1.2 目的基因与载体质粒的限制性酶切反应 | 第31-32页 |
| 1.2.1.3 目的基因与表达载体的连接及转化 | 第32页 |
| 1.2.1.4 菌落PCR及测序鉴定 | 第32-33页 |
| 1.2.1.5 重组质粒的转化与鉴定 | 第33页 |
| 1.3 关键酶基因在大肠杆菌中的诱导与表达 | 第33-34页 |
| 1.4 关键酶的纯化 | 第34页 |
| 1.5 结果与分析 | 第34-36页 |
| 1.5.1 MDH基因克隆与大肠杆菌表达载体构建 | 第34-35页 |
| 1.5.2 四种关键酶的表达与纯化 | 第35-36页 |
| 1.6 小结 | 第36-39页 |
| 第2章 甘露醇-2-脱氢酶与甲酸脱氢酶偶联催化反应 | 第39-46页 |
| 2.1 供试材料与实验仪器 | 第39页 |
| 2.1.1 供试材料 | 第39页 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 | 第39页 |
| 2.1.3 试剂配制 | 第39页 |
| 2.2 实验方法 | 第39-42页 |
| 2.2.1 酶动力学分析 | 第39-41页 |
| 2.2.1.1 甘露醇-2-脱氢酶催化反应动力学研究 | 第39-40页 |
| 2.2.1.2 甲酸脱氢酶催化反应动力学研究 | 第40-41页 |
| 2.2.1.3 甘露醇-2-脱氢酶与甲酸脱氢酶偶联催化反应酶动力学研究 | 第41页 |
| 2.2.2 MDH-FDH双酶级联反应实验方法 | 第41-42页 |
| 2.2.2.1 不同pH对双酶催化效率的影响 | 第41页 |
| 2.2.2.2 甘露醇-2-脱氢酶与甲酸脱氢酶双酶级联催化果糖生成甘露醇反应 | 第41-42页 |
| 2.2.3 液相色谱检测方法 | 第42页 |
| 2.3 结果与分析 | 第42-44页 |
| 2.3.1 不同pH的缓冲液对甘露醇转化率的影响 | 第42-43页 |
| 2.3.2 甘露醇-2-脱氢酶与甲酸脱氢酶双酶级联催化果糖生成甘露醇反应 | 第43-44页 |
| 2.4 小结 | 第44-46页 |
| 第3章 甘露醇-1-脱氢酶与NADH氧化酶偶联催化反应 | 第46-52页 |
| 3.1 供试材料与实验仪器 | 第46页 |
| 3.1.1 供试材料 | 第46页 |
| 3.1.2 实验仪器 | 第46页 |
| 3.2 实验方法 | 第46-49页 |
| 3.2.1 酶动力学分析 | 第46-48页 |
| 3.2.1.1 甘露醇-1-脱氢酶催化反应动力学研究 | 第46-47页 |
| 3.2.1.2 NADH氧化酶催化动力学研究 | 第47-48页 |
| 3.2.1.3 甘露醇-1-脱氢酶与NADH氧化酶耦联催化过程研究 | 第48页 |
| 3.2.3 关键酶甘露醇-1-脱氢酶温度稳定性实验 | 第48页 |
| 3.2.4 甘露醇浓度对反应结果的影响 | 第48-49页 |
| 3.2.5 MTD-NOX双酶级联反应实验方法 | 第49页 |
| 3.2.6 高效液相色谱检测方法 | 第49页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第49-51页 |
| 3.3.1 关键酶甘露醇-1-脱氢酶的温度稳定性 | 第49-50页 |
| 3.3.2 甘露醇浓度对反应结果的影响 | 第50-51页 |
| 3.3.3 甘露醇-1-脱氢酶与NADH氧化酶双酶催化反应结果 | 第51页 |
| 3.4 小结 | 第51-52页 |
| 第4章 四酶级联催化果糖转化甘露糖 | 第52-57页 |
| 4.1 供试材料与实验仪器 | 第52页 |
| 4.1.1 供试材料 | 第52页 |
| 4.1.2 实验仪器 | 第52页 |
| 4.2 实验方法 | 第52-54页 |
| 4.2.1 一锅法催化果糖转化甘露糖 | 第52-53页 |
| 4.2.2 一锅两步法催化果糖转化甘露糖 | 第53页 |
| 4.2.3 高效液相色谱检测方法 | 第53-54页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第54-55页 |
| 4.3.1 一锅法催化果糖转化甘露糖反应结果 | 第54页 |
| 4.3.2 一锅两步法催化果糖转化甘露糖反应结果 | 第54-55页 |
| 4.4 小结 | 第55-57页 |
| 第5章 关键酶甘露醇-1-脱氢酶延伸研究 | 第57-67页 |
| 5.1 引言 | 第57页 |
| 5.2 供试材料与实验仪器 | 第57-59页 |
| 5.2.1 供试材料 | 第57-58页 |
| 5.2.1.1 菌株 | 第57页 |
| 5.2.1.2 引物 | 第57-58页 |
| 5.2.1.3 质粒 | 第58页 |
| 5.2.2 培养基 | 第58-59页 |
| 5.2.3 主要试剂 | 第59页 |
| 5.3 实验方法 | 第59-63页 |
| 5.3.1 拟南芥cDNA合成 | 第59页 |
| 5.3.2 拟南芥甘露醇-1-脱氢酶基因AtMTD克隆与表达载体的构建 | 第59-61页 |
| 5.3.2.1 引物设计及目的基因的扩增 | 第59-60页 |
| 5.3.2.2 RF克隆法构建大肠杆菌表达载体 | 第60页 |
| 5.3.2.3 重组质粒的转化与鉴定 | 第60-61页 |
| 5.3.3 拟南芥甘露醇-1-脱氢酶在毕赤酵母中的诱导与表达 | 第61-62页 |
| 5.3.3.1 重组质粒的线性化及转化 | 第61-62页 |
| 5.3.3.2 拟南芥甘露醇-1-脱氢酶基因AtMTD的表达 | 第62页 |
| 5.3.4 胡萝卜甘露醇-1-脱氢酶在大肠杆菌中的诱导与表达 | 第62-63页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第63-65页 |
| 5.4.1 拟南芥甘露醇-1-脱氢酶基因AtMTD克隆与表达载体的构建 | 第63-64页 |
| 5.4.2 胡萝卜甘露醇-1-脱氢酶DcMTD的表达与纯化 | 第64-65页 |
| 5.5 小结 | 第65-67页 |
| 第6章 结论与展望 | 第67-68页 |
| 6.1 结论 | 第67页 |
| 6.2 工作不足与未来研究方向 | 第67-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-74页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况 | 第74-75页 |
