| 摘要 | 第5-8页 |
| ABSTRACT | 第8-11页 |
| 第1章 绪论 | 第15-25页 |
| 1.1 选题意义 | 第15-16页 |
| 1.2 研究现状 | 第16-23页 |
| 1.2.1 真菌α-淀粉酶来源和种类 | 第16-17页 |
| 1.2.2 真菌α-淀粉酶结构与催化机制 | 第17-18页 |
| 1.2.3 真菌α-淀粉酶的应用 | 第18-19页 |
| 1.2.4 影响蛋白质热稳定性和耐酸性的因素 | 第19-21页 |
| 1.2.5 蛋白质热稳定性和耐酸性的理性设计 | 第21-23页 |
| 1.3 研究目的及内容 | 第23-25页 |
| 1.3.1 研究目的 | 第23页 |
| 1.3.2 研究内容 | 第23-25页 |
| 第2章 基于同源序列比对分析ROAmy中与pH和温度耐受性相关的氨基酸结构 | 第25-44页 |
| 2.1 实验材料 | 第25-26页 |
| 2.1.1 菌种、质粒和培养基 | 第25页 |
| 2.1.2 试剂与仪器 | 第25-26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-31页 |
| 2.2.1 米根霉α-淀粉酶3-D结构模型的构建 | 第26页 |
| 2.2.2 突变位点的确定及突变体设计 | 第26-27页 |
| 2.2.3 重组质粒的构建 | 第27-29页 |
| 2.2.4 重组乳酸克鲁维酵母的构建 | 第29页 |
| 2.2.5 重组菌的发酵及酶液纯化 | 第29页 |
| 2.2.6 蛋白质标准曲线和含量的测定 | 第29-30页 |
| 2.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备及电泳 | 第30页 |
| 2.2.8 突变体酶活及酶学性质的测定 | 第30-31页 |
| 2.2.9 动力学参数的测定 | 第31页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第31-43页 |
| 2.3.1 米根霉α-淀粉酶3D结构建模分析 | 第31-32页 |
| 2.3.2 突变体的设计 | 第32-35页 |
| 2.3.3 重组质粒的构建、转化及鉴定 | 第35-36页 |
| 2.3.4 重组乳酸克鲁维酵母的构建及筛选 | 第36-37页 |
| 2.3.5 重组菌的发酵及酶液的分离纯化 | 第37页 |
| 2.3.6 温度对酶活力及酶蛋白稳定性的影响 | 第37-38页 |
| 2.3.7 pH对酶活力及酶蛋白稳定性的影响 | 第38-39页 |
| 2.3.8 动力学参数结果分析 | 第39-40页 |
| 2.3.9 热稳定性和耐酸性分子机制分析 | 第40-43页 |
| 2.4 小结 | 第43-44页 |
| 第3章 基于B-factor和分子动力学模拟分析ROAmy中与pH和温度耐受性相关的氨基酸结构 | 第44-56页 |
| 3.1 实验材料 | 第44页 |
| 3.1.1 菌种、质粒和培养基 | 第44页 |
| 3.1.2 试剂与仪器 | 第44页 |
| 3.2 实验方法 | 第44-45页 |
| 3.2.1 B-factor的获取和分子动力学模拟 | 第44-45页 |
| 3.2.2 突变体设计 | 第45页 |
| 3.2.3 重组质粒的构建 | 第45页 |
| 3.2.4 重组乳酸克鲁维酵母的构建 | 第45页 |
| 3.2.5 重组菌的发酵及酶液纯化 | 第45页 |
| 3.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白含量测定 | 第45页 |
| 3.2.7 突变体酶学性质的测定 | 第45页 |
| 3.2.8 动力学参数的测定 | 第45页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第45-55页 |
| 3.3.1 突变体的设计 | 第45-47页 |
| 3.3.2 重组质粒的构建、筛选及鉴定 | 第47-48页 |
| 3.3.3 重组乳酸克鲁维酵母的构建及筛选 | 第48-49页 |
| 3.3.4 重组菌的发酵及酶液的分离纯化 | 第49页 |
| 3.3.5 温度对酶活力及酶蛋白稳定性的影响 | 第49-50页 |
| 3.3.6 pH对酶活力及酶蛋白稳定性的影响 | 第50-52页 |
| 3.3.7 动力学参数结果分析 | 第52页 |
| 3.3.8 热稳定性的分子机制分析 | 第52-55页 |
| 3.4 小结 | 第55-56页 |
| 第4章 二硫键对ROAmy pH和温度耐受性的影响 | 第56-65页 |
| 4.1 实验材料 | 第56页 |
| 4.1.1 菌种、质粒和培养基 | 第56页 |
| 4.1.2 试剂与仪器 | 第56页 |
| 4.2 实验方法 | 第56-57页 |
| 4.2.1 ROAmy和黑曲霉α-淀粉酶(2aaa)分子重叠 | 第56页 |
| 4.2.2 突变位点的确定及突变体设计 | 第56页 |
| 4.2.3 重组质粒的构建 | 第56-57页 |
| 4.2.4 重组乳酸克鲁维酵母的构建 | 第57页 |
| 4.2.5 重组菌的发酵及酶液纯化 | 第57页 |
| 4.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白含量测定 | 第57页 |
| 4.2.7 突变体酶学性质的测定 | 第57页 |
| 4.2.8 动力学参数的测定 | 第57页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第57-64页 |
| 4.3.1 突变体的设计 | 第57-59页 |
| 4.3.2 重组质粒的构建、转化及鉴定 | 第59-60页 |
| 4.3.3 重组乳酸克鲁维酵母的构建及筛选 | 第60页 |
| 4.3.4 重组菌的发酵及酶液的分离纯化 | 第60-61页 |
| 4.3.5 温度对酶活力及酶蛋白稳定性的影响 | 第61-62页 |
| 4.3.6 pH对酶活力及酶蛋白稳定性的影响 | 第62-63页 |
| 4.3.7 动力学参数结果分析 | 第63-64页 |
| 4.4 小结 | 第64-65页 |
| 第5章 结论与展望 | 第65-67页 |
| 结论 | 第65-66页 |
| 展望 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-77页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
