| 致谢 | 第8-17页 |
| 缩写词 | 第17-19页 |
| 摘要 | 第19-21页 |
| Abstract | 第21-23页 |
| 前言 | 第24-28页 |
| 1 文献综述:高等植物MAPK功能与花粉发育研究进展 | 第28-46页 |
| 1.1 植物花药的发育与花粉粒形成 | 第28-31页 |
| 1.1.1 花药的发育 | 第28-29页 |
| 1.1.2 花粉粒的发育与形态结构 | 第29-31页 |
| 1.2 花粉发育相关基因研究进展 | 第31-35页 |
| 1.2.1 花粉发育前期相关的基因 | 第31-32页 |
| 1.2.2 与减数分裂后花粉发育相关的基因 | 第32-35页 |
| 1.2.2.1 糖代谢与糖信号转导相关基因 | 第33-34页 |
| 1.2.2.2 植物激素合成与信号转导相关基因 | 第34-35页 |
| 1.3 高等植物中MAPK的研究进展 | 第35-46页 |
| 1.3.1 高等植物中的MAPK | 第35-36页 |
| 1.3.2 TEY MAPKs的研究进展 | 第36-41页 |
| 1.3.2.1 参与植物的生殖生长发育 | 第37-38页 |
| 1.3.2.2 参与植物的营养生长发育 | 第38页 |
| 1.3.2.3 参与植物激素信号转导 | 第38-39页 |
| 1.3.2.4 参与植物的生物胁迫反应 | 第39-41页 |
| 1.3.2.5 参与植物的非生物胁迫反应 | 第41页 |
| 1.3.3 植物特有的TDY MAPKs的研究进展 | 第41-42页 |
| 1.3.4 MAPK下游作用因子的识别方法 | 第42页 |
| 1.3.5 MAPK下游底物的功能 | 第42-46页 |
| 2 番茄促分裂原活化蛋白激酶基因SlMPK20的表达分析 | 第46-72页 |
| 2.1 材料与方法 | 第46-58页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第46-47页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第47-48页 |
| 2.1.3 植物DNA、RNA的提取和cDNA合成 | 第48-49页 |
| 2.1.3.1 植物DNA的提取 | 第48页 |
| 2.1.3.2 植物RNA的提取和cDNA合成 | 第48-49页 |
| 2.1.4 番茄MAPK基因SlMPK20在不同物种中同源基因的查找及进化分析 | 第49页 |
| 2.1.5 SlMPK20的时空表达分析 | 第49-53页 |
| 2.1.5.1 荧光实时定量PCR分析 | 第49-50页 |
| 2.1.5.2 植物组织原位杂交分析 | 第50-53页 |
| 2.1.6 SlMPK20启动子序列的分离与表达活性分析 | 第53-55页 |
| 2.1.6.1 启动子融合表达载体的构建及农杆菌转化 | 第53页 |
| 2.1.6.2 启动子的活性检测 | 第53页 |
| 2.1.6.3 启动子融合表达载体对拟南芥的遗传转化和筛选 | 第53-54页 |
| 2.1.6.4 启动子融合表达载体在拟南芥中的表达分析 | 第54-55页 |
| 2.1.7 SlMPK20原核表达 | 第55-57页 |
| 2.1.7.1 原核表达载体的构建及对大肠杆菌菌株Rosetta的转化 | 第55页 |
| 2.1.7.2 SlMPK20融合蛋白的原核诱导表达与纯化 | 第55-56页 |
| 2.1.7.3 SlMPK20融合蛋白的SDS-PAGE及Western Blot印迹分析 | 第56-57页 |
| 2.1.8 SlMPK20亚细胞定位分析 | 第57-58页 |
| 2.1.8.1 SlMPK20过表达基因序列的分离 | 第57页 |
| 2.1.8.2 Gateway体系入门载体的构建 | 第57页 |
| 2.1.8.3 LR反应连接Gateway载体 | 第57-58页 |
| 2.1.8.4 利用基因枪介导的洋葱内表皮细胞瞬时表达体系分析SlMPK20亚细胞定位 | 第58页 |
| 2.2 结果与分析 | 第58-69页 |
| 2.2.1 SlMPK20的蛋白结构及进化分析 | 第58-61页 |
| 2.2.2 SlMPK20编码蛋白定位于细胞核、细胞膜和细胞质 | 第61-64页 |
| 2.2.2.1 SlMPK20能够编码一个70.5KD的蛋白 | 第61-62页 |
| 2.2.2.2 SlMPK20蛋白定位于细胞核、细胞膜和细胞质 | 第62-64页 |
| 2.2.3 SlMPK20在番茄雄蕊中优势表达 | 第64-69页 |
| 2.2.3.1 qRT-PCR分析SlMPK20在番茄不同组织器官中的时空表达 | 第64-65页 |
| 2.2.3.2 原位杂交分析SlMPK20在番茄雄蕊不同发育阶段的时空表达 | 第65-66页 |
| 2.2.3.3 SlMPK20启动子在拟南芥花序中优势表达 | 第66-69页 |
| 2.3 讨论 | 第69-72页 |
| 2.3.1 SlMPK20编码一个定位于细胞核、细胞膜和细胞质的TDY MAPK | 第69页 |
| 2.3.2 SlMPK20在番茄雄蕊中优势表达 | 第69页 |
| 2.3.3 SlMPK20可能参与调控番茄生殖生长发育过程 | 第69-72页 |
| 3 番茄SlMPK20的生物学功能分析 | 第72-108页 |
| 3.1 材料与方法 | 第72-84页 |
| 3.1.1 植物材料 | 第72-73页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第73页 |
| 3.1.3 番茄LAT52启动的SlMPK20 RNA干涉载体的构建 | 第73-74页 |
| 3.1.3.1 正义片段和反义片段序列的扩增 | 第73页 |
| 3.1.3.2 构建pLAT52:: pCAMBIA1301载体 | 第73-74页 |
| 3.1.4 SlMPK20过表达载体的构建 | 第74-75页 |
| 3.1.4.1 SlMPK20过表达片段的制备 | 第74页 |
| 3.1.4.2 构建SlMPK20过表达载体 | 第74-75页 |
| 3.1.5 SlMPK20 CRISPR/Cas9敲除载体的构建 | 第75-76页 |
| 3.1.5.1 设计SlMPK20基因的靶序列 | 第75页 |
| 3.1.5.2 构建SlMPK20 CRISPR/Cas9敲除载体 | 第75-76页 |
| 3.1.6 SlMPK20过表达载体、RNA干涉载体及CRISPR/Cas9敲除载体对番茄的遗传转化 | 第76-78页 |
| 3.1.6.1 培养基的配置 | 第76-77页 |
| 3.1.6.2 播种培养 | 第77页 |
| 3.1.6.3 预培养 | 第77页 |
| 3.1.6.4 共培养 | 第77-78页 |
| 3.1.6.5 分化培养 | 第78页 |
| 3.1.6.6 继代培养与生根培养 | 第78页 |
| 3.1.6.7 练苗与移栽 | 第78页 |
| 3.1.7 RNAi及CR转基因植株的分子检测 | 第78-81页 |
| 3.1.7.1 PCR检测 | 第78-79页 |
| 3.1.7.2 GUS组织化学染色 | 第79-80页 |
| 3.1.7.3 QRT-PCR检测 | 第80页 |
| 3.1.7.4 SlMPK20 CRISPR/Cas9敲除转基因植株的脱靶检测 | 第80-81页 |
| 3.1.8 RNAi及敲除转基因番茄植株形态和细胞学观察 | 第81-84页 |
| 3.1.8.1 RNAi及敲除转基因植株的形态观察 | 第81页 |
| 3.1.8.2 花粉活力及花粉萌发率观察 | 第81-82页 |
| 3.1.8.3 花粉形态扫描电镜观察 | 第82-83页 |
| 3.1.8.4 番茄雄蕊半薄切片观察 | 第83页 |
| 3.1.8.5 番茄雄蕊透射电镜观察 | 第83-84页 |
| 3.1.8.6 番茄花和果实性状观察与统计分析 | 第84页 |
| 3.1.8.7 番茄基因敲除纯合突变体杂交验证 | 第84页 |
| 3.2 结果与分析 | 第84-106页 |
| 3.2.1 成功构建SlMPK20 RNAi、CRISPR/Cas9敲除以及过表达载体 | 第84-87页 |
| 3.2.1.1 SlMPK20 RNA干涉载体 | 第84-86页 |
| 3.2.1.2 SlMPK20 CRISPR/Cas9敲除载体 | 第86页 |
| 3.2.1.3 SlMPK20过表达载体 | 第86-87页 |
| 3.2.2 SlMPK20不同类型转基因植株的获得与验证 | 第87-94页 |
| 3.2.2.1 获得SlMPK20 RNAi、CRISPR/Cas9敲除和SlMPK20过表达载体转化番茄植株 | 第87页 |
| 3.2.2.2 PCR和GUS染色验证番茄转基因植株 | 第87-89页 |
| 3.2.2.3 SlMPK20在SlMPK20 RNAi转基因植株的花序中的表达受到抑制 | 第89-90页 |
| 3.2.2.4 SlMPK20蛋白在CRISPR/Cas9敲除转基因植株花序中的表达受阻 | 第90-91页 |
| 3.2.2.5 SlMPK20干涉或敲除并不影响SlMAPK D亚组其他基因的表达 | 第91页 |
| 3.2.2.6 SlMPK20 CRISPR/Cas9敲除没有脱靶 | 第91-94页 |
| 3.2.3 敲除或抑制SlMPK20表达影响番茄花粉与果实发育 | 第94-99页 |
| 3.2.3.1 敲除或抑制SlMPK20表达不影响番茄正常营养生长与开花 | 第94页 |
| 3.2.3.2 敲除或抑制SlMPK20表达可引起番茄花粉败育 | 第94-98页 |
| 3.2.3.3 敲除或抑制SlMPK20表达影响果实正常发育,对雌性生殖发育无明显影响 | 第98-99页 |
| 3.2.4 敲除或抑制SlMPK20表达对花粉细胞学结构的影响 | 第99-106页 |
| 3.2.4.1 敲除或抑制SlMPK20表达导致花粉在单核中后期发生败育 | 第99-104页 |
| 3.2.4.2 敲除或组织特异性抑制SlMPK20表达导致花粉内含物降解,花粉粒皱缩 | 第104-106页 |
| 3.3 讨论 | 第106-108页 |
| 3.3.1 SlMPK20在番茄花粉发育过程中发挥重要作用 | 第106页 |
| 3.3.2 RNAi技术和CRISPR/Cas9系统编辑植物基因组的比较 | 第106-108页 |
| 4 SlMPK20在花粉发育基因调控网络中的作用研究 | 第108-134页 |
| 4.1 材料与方法 | 第109-113页 |
| 4.1.1 植物材料 | 第109页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第109页 |
| 4.1.3 植物总RNA的提取及质量检测 | 第109-110页 |
| 4.1.4 RNA文库的构建及测序 | 第110页 |
| 4.1.5 测序数据处理 | 第110-112页 |
| 4.1.5.1 生物信息学分析流程 | 第110-111页 |
| 4.1.5.2 基因表达量分析与差异基因表达分析 | 第111-112页 |
| 4.1.6 植物激素测定方法 | 第112-113页 |
| 4.1.7 植物雄蕊糖含量测定方法 | 第113页 |
| 4.2 结果与分析 | 第113-129页 |
| 4.2.1 抑制或敲除SlMPK20对花粉发育转录组变化的影响 | 第113-122页 |
| 4.2.2 花粉发育早期重要调控基因的表达变化 | 第122-124页 |
| 4.2.3 可能受SlMPK20调控的102个基因在花粉发育后期发挥重要作用 | 第124-126页 |
| 4.2.4 糖代谢与激素代谢相关基因的表达分析 | 第126-128页 |
| 4.2.5 不同发育时期糖与激素含量的变化 | 第128-129页 |
| 4.3 讨论 | 第129-134页 |
| 4.3.1 SlMPK20对番茄雄蕊发育基因调控网络的影响 | 第129-130页 |
| 4.3.2 SlMPK20的抑制或敲除不影响绒毡层的发育 | 第130页 |
| 4.3.3 SlMPK20的敲除影响糖代谢和糖运输相关基因的表达 | 第130-131页 |
| 4.3.4 SlMPK20的敲除影响植物激素合成和信号转导相关基因 | 第131-134页 |
| 5 SlMPK20蛋白的互作因子筛选以及对花粉发育的调控途径研究 | 第134-172页 |
| 5.1 材料与方法 | 第134-147页 |
| 5.1.1 植物材料 | 第134-135页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第135页 |
| 5.1.3 酵母双杂交筛库试验 | 第135-141页 |
| 5.1.3.1 用于酵母双杂交筛库的诱饵载体pGBKT7- SlMPK20的构建 | 第135-136页 |
| 5.1.3.2 质粒转化酵母菌株Y187(LiAC法) | 第136-137页 |
| 5.1.3.3 SlMPK20蛋白对酵母毒性及其自激活活性的检测 | 第137-138页 |
| 5.1.3.4 番茄文库滴定 | 第138页 |
| 5.1.3.5 用融合法(mating)进行酵母双杂交筛库 | 第138-140页 |
| 5.1.3.6 酵母双杂交重组质粒的构建 | 第140页 |
| 5.1.3.7 酵母双杂交验证两种已知蛋白的互作 | 第140-141页 |
| 5.1.4 酵母双杂交试验检测SlMPK20蛋白与上游SlMAPKKs蛋白的互作 | 第141-142页 |
| 5.1.4.1 酵母双杂交重组质粒的构建 | 第141-142页 |
| 5.1.4.2 酵母双杂交分析 | 第142页 |
| 5.1.5 SlMPK20、SlMYB32与SlMKK4蛋白的亚细胞定位分析 | 第142-143页 |
| 5.1.5.1 亚细胞定位载体的构建 | 第142-143页 |
| 5.1.5.2 烟草瞬时表达 | 第143页 |
| 5.1.7 双分子荧光互补试验(BiFC) | 第143-145页 |
| 5.1.7.1 载体构建 | 第143-144页 |
| 5.1.7.2 农杆菌C58C1感受态的制备(CaCl2法) | 第144页 |
| 5.1.7.3 农杆菌浸润以及激光共聚焦观察BiFC的结果 | 第144-145页 |
| 5.1.8 SlMYB32 CRISPR/Cas9敲除载体的构建 | 第145-146页 |
| 5.1.8.1 SlMPK20与SlMKK4原核表达载体的构建及对大肠杆菌的转化 | 第145页 |
| 5.1.8.2 SlMKK4融合蛋白的原核诱导表达与纯化 | 第145-146页 |
| 5.1.8.3 Phos-tag体外磷酸化试验 | 第146页 |
| 5.1.10 蛋白定量组学分析(TMT标记) | 第146-147页 |
| 5.2 结果与分析 | 第147-169页 |
| 5.2.1 SlMPK20蛋白对酵母毒性及其自激活活性的检测 | 第147页 |
| 5.2.2 番茄中与SlMPK20互作蛋白的筛选 | 第147-148页 |
| 5.2.3 酵母双杂交验证SlMYB32与SlMPK20,SlMAPKKs与SlMPK20蛋白的互作 | 第148-153页 |
| 5.2.3.1 酵母双杂交验证SlMYB32与SlMAPKKs pGADT7重组载体的构建 | 第148-151页 |
| 5.2.3.2 酵母双杂交验证SlMYB32与SlMPK20, SlMAPKKs与SlMPK20蛋白的互作 | 第151-153页 |
| 5.2.4 SlMYB32与SlMKK4的亚细胞定位 | 第153-156页 |
| 5.2.4.1 SlMYB32与SlMKK4亚细胞定位载体的构建 | 第153-154页 |
| 5.2.4.2 利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达 | 第154-156页 |
| 5.2.5 BiFC验证SlMYB32与SlMPK20, SlMKK4与SlMPK20蛋白的互作 | 第156-160页 |
| 5.2.5.1 SlMPK20,SlMYB32和SlMKK4 BiFC载体的构建 | 第156-158页 |
| 5.2.5.2 BiFC验证SlMYB32与SlMPK20, SlMKK4与SlMPK20蛋白在植物体内的互作 | 第158-160页 |
| 5.2.6 Phos-tag体外磷酸化试验验证SlMKK4与SlMPK20蛋白的互作 | 第160-164页 |
| 5.2.7 蛋白定量组学分析 | 第164-169页 |
| 5.3 讨论 | 第169-172页 |
| 5.3.1 SlMYB32是SlMPK20的下游作用因子 | 第169-170页 |
| 5.3.2 SlMPK20通过SlMKK4-SlMPK20-SlMYB32级联途径在番茄减数分裂后花粉发育发挥重要作用 | 第170-172页 |
| 结论 | 第172-174页 |
| 参考文献 | 第174-200页 |
| 附录 | 第200-203页 |
