| Abstract | 第4-5页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| 1 Introduction | 第8-27页 |
| 1.1 Lipases | 第9-11页 |
| 1.2 Sources of lipase | 第11-12页 |
| 1.3 Structure of lipase | 第12-14页 |
| 1.3.1 Rhizomucor miehei Lipase (RML) R. miehei | 第13-14页 |
| 1.4 Yeast as a protein expression system | 第14-25页 |
| 1.4.1 Pichia pastoris expression system | 第15-25页 |
| 1.4.1.1 AOX1 and its promoter PAOX1 | 第17-18页 |
| 1.4.1.2 FLD1 and its promoter PFLD1 | 第18页 |
| 1.4.1.3 Strains of P. pastoris | 第18-19页 |
| 1.4.1.4 Recombination in P. pastoris | 第19-21页 |
| 1.4.1.5 Pichia expression vectors | 第21-23页 |
| 1.4.1.6 Chaperones in P. pastoris | 第23-24页 |
| 1.4.1.7 Codon optimization | 第24-25页 |
| Study goals | 第25-27页 |
| 2 Materials and methods | 第27-35页 |
| 2.1 Microbial Strains used in this study | 第27页 |
| 2.2 Medium and buffer solution | 第27-29页 |
| 2.3 Protocols used in the experiment | 第29-35页 |
| 2.3.1 Protocol for E. coli transformation | 第29页 |
| 2.3.2 Protocol for electroporation | 第29-30页 |
| 2.3.3 Plasmid Isolation protocol | 第30-31页 |
| 2.3.4 Protocol for Extraction of DNA from agarose gel or DNA recovory | 第31-32页 |
| 2.3.5 Shake flask cultivations | 第32-33页 |
| 2.3.6 Lipase activity assay | 第33页 |
| 2.3.7 List of primers used in this study | 第33-35页 |
| 3 Experimental Procedures | 第35-44页 |
| 3.1 Codon optimization | 第35-41页 |
| 3.2 Expression of RMLoriand RMLoptin P. pastoris | 第41-44页 |
| 4 Results and discussion | 第44-54页 |
| 4.1 Codon optimization | 第44-47页 |
| 4.2 Expression | 第47-50页 |
| 4.3 Enzymatic properties of recombinant RML | 第50-54页 |
| 4.3.1 Substrate specificity of RML (carbon chain length) | 第50页 |
| 4.3.2 Effect of temperature | 第50-51页 |
| 4.3.3 Effect of pH | 第51-52页 |
| 4.3.4 Effect of metal ions | 第52页 |
| 4.3.5 Thermostability of RML | 第52-54页 |
| 5. Conclusions and Future Study | 第54-55页 |
| 5.1 Conclusions | 第54页 |
| 5.2 Future study | 第54-55页 |
| 6. Acknowledgement | 第55-56页 |
| References | 第56-61页 |
| Appendix 1 Gene sequences | 第61-63页 |
| RML~(ori)sequence | 第61-62页 |
| RML~(opt)sequence | 第62-63页 |
| Appendix 2 Instruments and equipments | 第63页 |
