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稳定表达人BCRP的转基因COS-7细胞系的建立研究

摘要第5-7页
Abstract第7-8页
第一章 绪论第12-22页
    1.1 ATP 结合盒转运体概述第13-15页
        1.1.1 ATP 结合盒转运体的结构和分类第13-15页
        1.1.2 ABC 转运体的功能及运输机制第15页
    1.2 乳腺癌耐药蛋白概述第15-19页
        1.2.1 乳腺癌耐药蛋白结构与功能第15-17页
        1.2.2 BCRP 的底物和抑制剂第17-19页
    1.3 稳定细胞表达模型在药物转运体研究中的应用第19-20页
    1.4 本课题研究思路第20-22页
第二章 pcDNA3.1(+)-BCRP 真核表达载体的构建第22-31页
    2.1 实验仪器与材料第22-23页
        2.1.1 主要仪器设备第22页
        2.1.2 实验材料第22-23页
        2.1.3 实验相关试剂和培养基配制第23页
    2.2 实验方法第23-28页
        2.2.1 BCRP 基因的克隆第23-25页
        2.2.2 PCR 产物的回收与纯化第25-26页
        2.2.3 纯化 PCR 产物连接 pMD-19 T Simple第26页
        2.2.4 质粒测序及序列比对第26-27页
        2.2.5 测序正确的片段克隆入真核载体 pcDNA3.1(+)第27-28页
    2.3 实验结果第28-30页
        2.3.1 人 BCRP CDS 的克隆第28-29页
        2.3.2 人 BCRP CDS 扩增序列分析结果第29页
        2.3.3 真核表达质粒 pcDNA3.1(+)-BCRP 的构建第29-30页
    2.4 讨论与小结第30-31页
第三章 转染 COS-7 细胞及抗性细胞克隆的筛选第31-39页
    3.1 实验仪器与材料第31-32页
        3.1.1 主要仪器设备第31页
        3.1.2 实验材料第31页
        3.1.3 实验相关试剂和培养基配制第31-32页
    3.2 实验方法第32-35页
        3.2.1 细胞转染质粒的制备第32页
        3.2.2 细胞的复苏、传代及冻存第32-33页
        3.2.3 G418 对 COS-7 细胞毒性试验第33-34页
        3.2.4 质粒转染 COS-7 细胞第34页
        3.2.5 抗性细胞克隆的获得第34-35页
    3.3 实验结果第35-37页
        3.3.1 线性化质粒的浓度和纯度测定第35页
        3.3.2 G418 对 COS-7 细胞毒性试验结果第35-36页
        3.3.3 抗性单克隆细胞的获得第36-37页
    3.4 讨论与小结第37-39页
第四章 稳定表达人 BCRP 蛋白 COS-7 细胞系的鉴定及生物学活性研究第39-50页
    4.1 实验仪器与材料第39-40页
        4.1.1 实验主要仪器第39页
        4.1.2 实验材料第39页
        4.1.3 实验相关试剂配制第39-40页
    4.2 实验方法第40-45页
        4.2.1 抗性细胞克隆基因组 PCR 鉴定第40-41页
        4.2.2 SDS-PAGE 电泳鉴定第41-43页
        4.2.3 Bardford 法测蛋白浓度第43页
        4.2.4 COS-7/BCRP 细胞转运米托蒽醌活性实验第43页
        4.2.5 LC-MS/MS 测定 BCRP 对米托蒽醌的转运能力第43-45页
    4.3 实验结果第45-48页
        4.3.1 抗性细胞克隆基因组 PCR 检测第45-46页
        4.3.2 SDS-PAGE 结果第46页
        4.3.3 细胞中蛋白浓度的测定第46-47页
        4.3.4 细胞内米托蒽醌含量检测第47-48页
    4.4 讨论与小结第48-50页
结论与展望第50-52页
参考文献第52-57页
附录 人 BCRP 基因测序结果(部分)第57-58页
攻读硕士学位期间取得的研究成果第58-59页
致谢第59-60页
答辩委员会对论文的评定意见第60页

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