| 致谢 | 第8-9页 |
| 摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-35页 |
| 1 骨骼肌的结构及肌纤维的分类 | 第13-15页 |
| 1.1 骨骼肌纤维的光镜结构 | 第13-14页 |
| 1.2 骨骼肌纤维的超微结构 | 第14-15页 |
| 1.3 肌纤维的分类 | 第15页 |
| 2 肌纤维多样性的细胞学和分子学基础 | 第15-16页 |
| 3 肌形成过程 | 第16-17页 |
| 4 肌肉生长发育调控的分子机制 | 第17-20页 |
| 4.1 生肌调节因子家族(MRFs或MyoD) | 第17-19页 |
| 4.1.1 MRFs的分子结构 | 第17-18页 |
| 4.1.2 MRFs的生物学功能 | 第18页 |
| 4.1.3 MRFs的激活和表达 | 第18页 |
| 4.1.4 MRFs与其它蛋白因子的相互作用 | 第18-19页 |
| 4.1.5 MRFs基因与生产性能的关系 | 第19页 |
| 4.2 成肌增强因子家族(MEF2) | 第19-20页 |
| 4.3 Pax3蛋白 | 第20页 |
| 5 肌肉生长抑制素基因(Myostatin)的研究进展 | 第20-28页 |
| 5.1 Myostatin基因的结构、遗传效应及同源性分析 | 第20-22页 |
| 5.2 牛的Myostatin基因 | 第22-23页 |
| 5.3 人的Myostatin基因 | 第23页 |
| 5.4 绵羊的Myostatin基因 | 第23页 |
| 5.5 鱼的Myostatin基因 | 第23页 |
| 5.6 猪和鸡的Myostatin基因 | 第23-25页 |
| 5.7 Myostatin因子的作用机制 | 第25-26页 |
| 5.7.1 Myostatin的自分泌环作用机制 | 第25页 |
| 5.7.2 Myostatin抑制成肌细胞增殖的作用机制 | 第25-26页 |
| 5.7.3 Myostatin抑制成肌细胞分化的作用机制 | 第26页 |
| 5.8 Myostatin因子的信号传导途径 | 第26-28页 |
| 5.9 Myostatin的应用前景 | 第28页 |
| 6 甲醇酵母表达系统 | 第28-34页 |
| 6.1 甲醇酵母表达系统的原理 | 第29-30页 |
| 6.2 甲醇酵母的特性 | 第30页 |
| 6.3 甲醇酵母的宿主菌 | 第30-31页 |
| 6.4 表达载体的特性 | 第31-32页 |
| 6.5 甲醇酵母表达优势 | 第32页 |
| 6.6 甲醇酵母表达存在的问题 | 第32-33页 |
| 6.7 外源蛋白在甲醇酵母中的表达 | 第33-34页 |
| 7 本研究的目的与意义 | 第34-35页 |
| 第二章 Myostatin基因成熟区DNA的克隆及序列分析 | 第35-51页 |
| 1 引言 | 第35页 |
| 2 实验材料 | 第35-37页 |
| 2.1 实验动物 | 第35页 |
| 2.2 菌株和载体 | 第35-36页 |
| 2.3 主要试剂 | 第36-37页 |
| 2.4 酶和Marker | 第37页 |
| 3 实验方法 | 第37-42页 |
| 3.1 猪、鸡、鸭血样基因组DNA的提取 | 第37-38页 |
| 3.2 引物设计 | 第38页 |
| 3.3 PCR反应体系和条件 | 第38页 |
| 3.4 PCR产物电泳检测 | 第38-39页 |
| 3.4.1 2％琼脂糖凝胶的制备 | 第39页 |
| 3.4.2 电泳流程 | 第39页 |
| 3.5 PCR产物的克隆 | 第39-42页 |
| 3.5.1 连接反应 | 第39页 |
| 3.5.2 转化涂板 | 第39-40页 |
| 3.5.2.1 DH5α感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第39-40页 |
| 3.5.2.2 连接产物的转化涂板 | 第40页 |
| 3.5.2.2.1 含X-gal和IPTG的筛选培养基的制备 | 第40页 |
| 3.5.2.2.2 转化涂板的步骤 | 第40页 |
| 3.5.3 阳性重组子的筛选及鉴定 | 第40-42页 |
| 3.5.3.1 筛选原理(蓝白斑法) | 第40页 |
| 3.5.3.2 重组子的鉴定 | 第40-42页 |
| 3.5.3.2.1 菌液PCR初步鉴定 | 第41页 |
| 3.5.3.2.2 质粒DNA少量快速提取--碱裂解法 | 第41页 |
| 3.5.3.2.3 PCR扩增鉴定重组质粒 | 第41-42页 |
| 3.5.3.2.4 酶切鉴定重组质粒 | 第42页 |
| 3.6 阳性克隆重组子的测序 | 第42页 |
| 4 结果与分析 | 第42-47页 |
| 4.1 PCR扩增结果 | 第42-43页 |
| 4.2 阳性重组克隆子的PCR鉴定结果 | 第43页 |
| 4.3 酶切鉴定重组克隆子的结果 | 第43页 |
| 4.4 猪、鸡、鸭Myostatin成熟区段DNA的序列分析 | 第43-47页 |
| 4.5 系统进化树 | 第47页 |
| 5 讨论 | 第47-51页 |
| 第三章 猪、鸡Myostatin成熟区DNA在甲醇酵母(P.pastoris)中的融合表达 | 第51-63页 |
| 1 引言 | 第51页 |
| 2 实验材料 | 第51-53页 |
| 2.1 菌株和载体(由浙江大学动物科学学院遗传与育种实验室保存) | 第51-52页 |
| 2.2 主要试剂 | 第52-53页 |
| 3 实验方法 | 第53-59页 |
| 3.1 重组表达载体(Myostatin-pPIC9K)的构建 | 第53-55页 |
| 3.1.1 重组表达载体的构建思路 | 第53页 |
| 3.1.2 重组克隆载体(Myostatin-pUCm-T)的双酶切 | 第53页 |
| 3.1.3 目的DNA片段的回收 | 第53-54页 |
| 3.1.4 表达载体pPIC9K的双酶切 | 第54页 |
| 3.1.5 酶切载体的纯化 | 第54页 |
| 3.1.6 酶切产物的连接 | 第54-55页 |
| 3.1.7 菌液PCR初步鉴定 | 第55页 |
| 3.1.8 PCR检测重组子 | 第55页 |
| 3.1.9 酶切鉴定重组子 | 第55页 |
| 3.2 重组表达载体(Myostatin-pPIC9K)的测序 | 第55页 |
| 3.3 重组表达载体在甲醇酵母(P.pastoris)中的融合表达 | 第55-58页 |
| 3.3.1 重组表达质粒的大量提取及纯化 | 第55-56页 |
| 3.3.2 重组表达质粒的线性化 | 第56页 |
| 3.3.3 甲醇酵母(P.pastoris)电转化方法 | 第56-57页 |
| 3.3.3.1 酵母感受态的制备 | 第56页 |
| 3.3.3.2 电击转化 | 第56-57页 |
| 3.3.4 阳性菌斑的筛选 | 第57页 |
| 3.3.4.1 MD平板初选 | 第57页 |
| 3.3.4.2 接种含不同浓度G418的YPD液体培养基次选 | 第57页 |
| 3.3.4.3 涂布含G418(0.25mg／ml)的YPD平板再选 | 第57页 |
| 3.3.5 酵母染色体DNA PCR扩增鉴定阳性整合子 | 第57-58页 |
| 3.3.6 阳性整合子的诱导表达 | 第58页 |
| 3.4 SDS-PAGE电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测表达产物 | 第58-59页 |
| 3.4.1 分离胶和浓缩胶的配制 | 第58-59页 |
| 3.4.2 SDS-PAGE电泳的操作步骤 | 第59页 |
| 4 结果与分析 | 第59-61页 |
| 4.1 重组表达载体(Myostatin-pPIC9K)的PCR扩增结果 | 第59-60页 |
| 4.2 酶切鉴定重组表达载体(Myostatin-pPIC9K)的结果 | 第60页 |
| 4.3 重组表达载体(Myostatin-pPIC9K)的线性化电泳结果 | 第60-61页 |
| 4.4 阳性整合子的PCR扩增结果 | 第61页 |
| 4.5 SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的结果 | 第61页 |
| 5 讨论 | 第61-63页 |
| 第四章 结论及后续研究工作 | 第63-65页 |
| 参考文献(References) | 第65-72页 |
| 附录 | 第72-75页 |
