| 摘要 | 第11-13页 |
| ABSTRACT | 第13-15页 |
| 符号与缩略语说明 | 第16-17页 |
| 前言 | 第17-18页 |
| 第一部分 文献综述 | 第18-50页 |
| 第一章 有机磷农药的微生物降解 | 第18-40页 |
| 第一节 有机磷农药在环境中的降解方式 | 第18-23页 |
| 1 物理降解 | 第19-21页 |
| 1.1 光催化降解 | 第19-20页 |
| 1.2 超声波降解 | 第20-21页 |
| 2 化学降解 | 第21-23页 |
| 2.1 水解 | 第21页 |
| 2.2 氧化 | 第21-22页 |
| 2.3 生物降解 | 第22-23页 |
| 第二节 有机磷农药的微生物降解种类 | 第23-24页 |
| 第三节 有机磷农药的微生物降解机理 | 第24-25页 |
| 第四节 微生物降解有机磷农药的影响因子 | 第25-26页 |
| 1 理化因素 | 第25-26页 |
| 2 生化因素 | 第26页 |
| 第五节 有机磷农药的降解酶基因研究进展 | 第26-30页 |
| 第六节 微生物降解有机磷农药的应用探索 | 第30-32页 |
| 1 生物降解 | 第30-31页 |
| 2 工程菌株的构建及应用 | 第31页 |
| 3 酶制剂的研发 | 第31-32页 |
| 第七节 有机磷农药微生物降解的研究展望 | 第32页 |
| 参考文献 | 第32-40页 |
| 第二章 水胺硫磷的微生物降解研究进展 | 第40-44页 |
| 第一节 水胺硫磷的主要物化性质及用途 | 第40页 |
| 第二节 水胺硫磷的生态毒理 | 第40-41页 |
| 第三节 水胺硫磷的残留 | 第41-42页 |
| 第四节 水胺硫磷的降解 | 第42-43页 |
| 参考文献 | 第43-44页 |
| 第三章 乐果的微生物降解研究进展 | 第44-50页 |
| 第一节 乐果的主要物化性质及用途 | 第44-45页 |
| 第二节 乐果的残留 | 第45-46页 |
| 第三节 乐果的生态毒理 | 第46页 |
| 第四节 乐果残留污染的危害 | 第46-47页 |
| 第五节 乐果污染的微生物修复技术 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-50页 |
| 第二部分 实验部分 | 第50-138页 |
| 第一章 水胺硫磷降解菌的分离、降解特性、代谢途径及水解酶基因oph的克隆 | 第50-98页 |
| 第一节 水胺硫磷降解菌株的分离及其降解特性的研究 | 第50-67页 |
| 1 材料与方法 | 第50-54页 |
| 1.1 培养基与试剂 | 第50-51页 |
| 1.2 降解菌株的分离筛选 | 第51页 |
| 1.3 降解菌株的生理生化鉴定 | 第51页 |
| 1.4 降解菌株16S rRNA序列分析 | 第51-53页 |
| 1.4.1 菌体总DNA的提取 | 第51页 |
| 1.4.2 降解菌株16S rRNA序列的PCR扩增 | 第51-52页 |
| 1.4.3 PCR产物的T/A克隆 | 第52页 |
| 1.4.4 普通感受态细胞的制备 | 第52页 |
| 1.4.5 T/A克隆子转化感受态细胞 | 第52页 |
| 1.4.6 质粒DNA的小量提取 | 第52-53页 |
| 1.4.7 16S rRNA序列测定 | 第53页 |
| 1.5 降解菌株系统发育地位的确定 | 第53页 |
| 1.6 水胺硫磷提取方法和检测方法的建立 | 第53页 |
| 1.7 水胺硫磷的降解实验 | 第53-54页 |
| 1.8 菌株scl-2对有机磷农药的降解谱 | 第54页 |
| 1.9 菌株scl-2降解部分有机磷农药的GC-MS分析 | 第54页 |
| 1.10 降解菌株scl-2对南丰蜜桔水胺硫磷污染修复 | 第54页 |
| 2 结果与分析 | 第54-66页 |
| 2.1 环境样品中水胺硫磷降解菌株的分离筛选 | 第54-55页 |
| 2.2 菌株scl-2的菌体形态及生理生化特征 | 第55-56页 |
| 2.3 菌株scl-2的基因组DNA提取 | 第56页 |
| 2.4 菌株scl-2的16S rRNA系统进化分析 | 第56-58页 |
| 2.5 菌株scl-2利用水胺硫磷作为唯一碳源的生长和降解 | 第58页 |
| 2.6 环境条件对菌株scl-2降解水胺硫磷的影响 | 第58-61页 |
| 2.6.1 初始温度对菌株scl-2降解水胺硫磷的影响 | 第58-59页 |
| 2.6.2 初始pH对菌株scl-2降解水胺硫磷的影响 | 第59页 |
| 2.6.3 农药浓度对菌株scl-2降解水胺硫磷的影响 | 第59-60页 |
| 2.6.4 外加营养物质对菌株scl-2降解水胺硫磷的影响 | 第60-61页 |
| 2.7 菌株scl-2降解有机磷农药的降解谱 | 第61页 |
| 2.8 菌株scl-2降解部分有机磷农药的GC-MS图 | 第61-65页 |
| 2.9 菌株scl-2对水胺硫磷在南丰蜜桔上的污染修复 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-67页 |
| 第二节 菌株scl-2代谢水胺硫磷途径的分析 | 第67-75页 |
| 1 材料与方法 | 第67-69页 |
| 1.1 供试菌株、试剂、培养基 | 第67-68页 |
| 1.2 水胺硫磷、水杨酸异丙酯、水杨酸和龙胆酸标准品检测方法的建立 | 第68页 |
| 1.3 样品中水胺硫磷和代谢产物的提取和检测方法的建立 | 第68页 |
| 1.4 龙胆酸开环酶系的提取与活性鉴定 | 第68-69页 |
| 2 结果与分析 | 第69-75页 |
| 2.1 水胺硫磷降解过程中代谢产物的检测 | 第69页 |
| 2.2 代谢产物累积的液相色谱检测 | 第69-72页 |
| 2.3 代谢产物MS/MS分析 | 第72页 |
| 2.4 龙胆酸开环酶系的检测 | 第72-73页 |
| 2.5 水胺硫磷代谢途径的初步确立 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75页 |
| 第三节 水胺硫磷降解关键酶基因的克隆表达及酶学性质的研究 | 第75-94页 |
| 1 材料与方法 | 第76-82页 |
| 1.1 培养基与试剂 | 第76页 |
| 1.2 所用菌株与质粒 | 第76-77页 |
| 1.3 菌体总DNA的提取 | 第77页 |
| 1.4 质粒DNA的提取 | 第77页 |
| 1.5 感受态细胞的制备 | 第77页 |
| 1.6 有机磷农药水解酶基因片断的PCR扩增 | 第77-78页 |
| 1.7 完整有机磷农药水解酶结构基因oph的PCR扩增 | 第78页 |
| 1.8 有机磷农药水解酶基因表达载体的构建 | 第78页 |
| 1.9 有机磷农药水解酶基因的高效表达及酶的纯化 | 第78-79页 |
| 1.10 有机磷农药水解酶的纯化 | 第79-80页 |
| 1.11 聚丙烯酰胺凝胶的灌制 | 第80页 |
| 1.11.1 电泳 | 第80页 |
| 1.11.2 染色脱色 | 第80页 |
| 1.12 有机磷农药水解酶酶活性质的研究 | 第80-82页 |
| 1.12.1 等电点的测定 | 第80-81页 |
| 1.12.2 酶活测定体系的建立 | 第81页 |
| 1.12.3 有机磷农药水解酶的降解谱测定及反应动力学参数 | 第81页 |
| 1.12.4 有机磷农药水解酶水解水胺硫磷、甲基异柳磷GC-MS分析 | 第81-82页 |
| 2 结果与分析 | 第82-94页 |
| 2.1 有机磷农药水解酶基因oph的PCR扩增 | 第82页 |
| 2.2 基因序列比较分析 | 第82-85页 |
| 2.3 氨基酸序列比较分析 | 第85-86页 |
| 2.4 有机磷农药水解酶的表达与功能研究 | 第86-88页 |
| 2.4.1 表达载体的构建 | 第86-87页 |
| 2.4.2 有机磷农药水解酶在大肠杆菌中表达与纯化 | 第87页 |
| 2.4.3 有机磷农药水解酶SDS-PAGE分析 | 第87-88页 |
| 2.5 有机磷农药水解酶OPD酶学特性研究 | 第88-93页 |
| 2.5.1 有机磷农药水解酶OPD等电点的测定 | 第88页 |
| 2.5.2 有机磷农药水解酶OPD活性反应体系 | 第88页 |
| 2.5.3 温度对有机磷农药水解酶OPD活性的影响及酶的热稳定性 | 第88-89页 |
| 2.5.4 pH对有机磷农药水解酶OPD活性的影响及酶的酸碱稳定性 | 第89-90页 |
| 2.5.5 金属离子对酶活性的影响 | 第90-91页 |
| 2.5.6 有机磷农药水解酶的降解谱及对不同有机磷农药的动力学参数 | 第91-93页 |
| 2.6 有机磷农药水解酶降解水胺硫磷、甲基异柳磷的GC-MS分析 | 第93-94页 |
| 本章讨论 | 第94-95页 |
| 本章小结 | 第95-96页 |
| 参考文献 | 第96-98页 |
| 第二章 乐果降解菌株的分离、降解特性及代谢途径研究 | 第98-118页 |
| 第一节 乐果降解菌株的分离,降解特性研究 | 第98-107页 |
| 1 材料与方法 | 第98-100页 |
| 1.1 培养基与试剂 | 第98页 |
| 1.2 降解菌株的分离 | 第98-99页 |
| 1.3 降解菌株的生理生化鉴定 | 第99页 |
| 1.4 降解菌株16S rRNA序列的扩增和测定 | 第99-100页 |
| 1.4.1 菌体总DNA的提取 | 第99页 |
| 1.4.2 降解菌株16S rRNA的PCR扩增 | 第99页 |
| 1.4.3 PCR产物的T/A克隆 | 第99页 |
| 1.4.4 普通感受态细胞的制备 | 第99页 |
| 1.4.5 T/A克隆子转化感受态细胞 | 第99页 |
| 1.4.6 质粒DNA的小量提取 | 第99页 |
| 1.4.7 16S rRNA序列测定 | 第99-100页 |
| 1.5 降解菌株系统发育地位的确定 | 第100页 |
| 1.6 乐果提取方法和检测方法的建立 | 第100页 |
| 1.7 乐果的降解实验 | 第100页 |
| 2 结果与分析 | 第100-103页 |
| 2.1 环境样品中乐果降解菌株的分离筛选 | 第100-101页 |
| 2.2 菌株lgjj-3的菌体形态及生理生化特征 | 第101-102页 |
| 2.3 菌株lgjj-3的16S rRNA系统进化分析 | 第102-103页 |
| 2.4 菌株lgjj-3利用乐果作为唯一碳源生长和降解 | 第103页 |
| 2.5 环境条件对菌株lgjj-3降解乐果的影响 | 第103-105页 |
| 2.5.1 温度对菌株lgjj-3降解乐果的影响 | 第103-104页 |
| 2.5.2 初始pH值对菌株lgjj-3降解乐果的影响 | 第104-105页 |
| 2.5.3 农药浓度对菌株lgjj-3降解乐果的影响 | 第105页 |
| 2.5.4 外加营养物质对菌株lgjj-3降解乐果的影响 | 第105页 |
| 2.6 菌株lgjj-3的降解谱 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-107页 |
| 第二节 Paracoccus sp.lgjj-3降解乐果途径的分析 | 第107-118页 |
| 1 材料与方法 | 第108-109页 |
| 1.1 供试菌株、试剂、培养基 | 第108-109页 |
| 1.2 样品中乐果和代谢产物的提取鉴定 | 第109页 |
| 1.3 MS/MS检测乐果代谢产物 | 第109页 |
| 1.4 GC-MS检测代谢产物 | 第109页 |
| 2 结果与分析 | 第109-117页 |
| 2.1 代谢产物的MS/MS检测 | 第109-111页 |
| 2.2 代谢产物的GC-MS检测 | 第111-115页 |
| 2.3 乐果代谢途径的初步确立 | 第115-117页 |
| 本章讨论 | 第117页 |
| 本章小结 | 第117页 |
| 参考文献 | 第117-118页 |
| 第三章 染色体无标记随机整合载体的构建及有机磷农药降解工程菌株的构建 | 第118-138页 |
| 1 材料与方法 | 第119-124页 |
| 1.1 培养基与试剂 | 第119页 |
| 1.2 所用菌株与质粒 | 第119-121页 |
| 1.3 PCR产物的纯化及T/A克隆 | 第121页 |
| 1.4 质粒DNA的提取和感受态细胞的制备 | 第121页 |
| 1.5 有机磷农药水解酶基因的PCR扩增 | 第121页 |
| 1.6 随机整合载体pUTTnsKm的构建 | 第121-122页 |
| 1.7 随机整合载体pUTTnsCm和pUTTnsTet的构建 | 第122-123页 |
| 1.8 将有机磷农药水解酶基因mpd和oph整合入载体pUTTns | 第123页 |
| 1.9 三亲结合将mpd基因插入到受体菌染色体及无外源抗性基因重组子的筛选 | 第123页 |
| 1.10 三亲结合将oph基因插入到受体菌染色体及无外源抗性重组子的筛选 | 第123-124页 |
| 1.11 菌株生长和农药含量的分析方法 | 第124页 |
| 1.12 有机磷农药降解工程菌株对目前国内普遍使用有机磷农药的降解情况 | 第124页 |
| 2 结果与分析 | 第124-134页 |
| 2.1 随机整合载体pUTTns系列载体及带有外源基因载体的构建 | 第124-127页 |
| 2.2 构建不带外源抗生素抗性基因的工程菌株 | 第127-128页 |
| 2.3 在带有mpd基因的工程菌株中再次插入oph基因 | 第128-131页 |
| 2.4 工程菌株生长和降解及外源基因表达稳定性 | 第131-133页 |
| 2.5 工程菌株Paracoccus sp.L3-mpd-oph有机磷农药降解谱研究 | 第133-134页 |
| 本章讨论 | 第134页 |
| 本章小结 | 第134-135页 |
| 参考文献 | 第135-138页 |
| 全文总结 | 第138-140页 |
| 研究的主要创新点 | 第140-142页 |
| 研究的不足之处以及对纵深研究的建议 | 第142-144页 |
| 附录1 文中所用培养基及试剂配方 | 第144-146页 |
| 附录2 有关核酸序列 | 第146-156页 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 | 第156-158页 |
| 攻读博士学位期间参与申请的专利 | 第158-160页 |
| 致谢 | 第160页 |
