| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 1. 文献综述 | 第13-26页 |
| 1.1 细胞自噬简介 | 第13-16页 |
| 1.1.1 自噬的诱导 | 第14-15页 |
| 1.1.2 自噬泡的形成 | 第15页 |
| 1.1.3 自噬体与溶酶体对接和融合 | 第15-16页 |
| 1.1.4 自噬小体(autophagic body)分解 | 第16页 |
| 1.2 昆虫变态发育过程中的细胞自噬相关研究 | 第16-18页 |
| 1.2.1 蜕皮激素诱导高水平自噬发生 | 第16-17页 |
| 1.2.2 昆虫细胞高水平自噬可触发凋亡 | 第17-18页 |
| 1.3 自噬相关基因Atg5的作用 | 第18-20页 |
| 1.3.1 促进自噬体的形成 | 第18-19页 |
| 1.3.2 细胞自噬到凋亡转换的分子开关 | 第19-20页 |
| 1.3.3 参与细胞免疫过程 | 第20页 |
| 1.4 细胞自噬在先天性免疫过程中的作用 | 第20-25页 |
| 1.4.1 细胞自噬与细胞内感染的病原体相互作用 | 第21-22页 |
| 1.4.2 病原体感染能够触发自噬 | 第22-23页 |
| 1.4.3 侵入的病原体被靶向运输到自噬体 | 第23-24页 |
| 1.4.4 自噬在果蝇抗病毒免疫中的作用 | 第24-25页 |
| 1.5 本课题的研究意义 | 第25-26页 |
| 2. 材料和方法 | 第26-44页 |
| 2.1 实验材料 | 第26-28页 |
| 2.1.1 实验用昆虫和病毒来源 | 第26页 |
| 2.1.2 主要药品与试剂 | 第26页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第26-27页 |
| 2.1.4 引物序列 | 第27-28页 |
| 2.2 甜菜夜蛾和二化螟Atg5基因保守片段的扩增 | 第28-29页 |
| 2.2.1 总RNA的提取 | 第28页 |
| 2.2.2 cDNA的合成 | 第28-29页 |
| 2.2.3 甜菜夜蛾和二化螟Atg5基因保守片段的PCR扩增 | 第29页 |
| 2.3 SMARTer RACE技术克隆Atg5基因全长 | 第29-32页 |
| 2.3.1 cDNA模板的获得 | 第30页 |
| 2.3.2 RACE反应 | 第30-32页 |
| 2.4 DH5α感受态细胞的制备 | 第32页 |
| 2.5 克隆载体的构建与筛选检测 | 第32-33页 |
| 2.5.1 PCR产物的纯化回收 | 第32页 |
| 2.5.2 目的DNA片段与pEASY-T1克隆载体的连接 | 第32页 |
| 2.5.3 连接产物转化 | 第32-33页 |
| 2.5.4 阳性克隆筛选 | 第33页 |
| 2.6 序列分析 | 第33-34页 |
| 2.7 Atg5基因的时空表达模式分析 | 第34-37页 |
| 2.7.1 甜菜夜蛾血淋巴的采集 | 第34页 |
| 2.7.2 甜菜夜蛾其他组织的采集 | 第34页 |
| 2.7.3 不同发育时期样品的采集 | 第34页 |
| 2.7.4 不同发育时期及不同组织的RNA提取 | 第34-35页 |
| 2.7.5 cDNA的合成 | 第35页 |
| 2.7.6 半定量时空表达分析 | 第35-36页 |
| 2.7.7 Real-Time PCR检测相对表达量 | 第36-37页 |
| 2.8 qRT-PCR检测病毒刺激后SeAtg5基因表达量的变化 | 第37页 |
| 2.8.1 试虫的注射及取样 | 第37页 |
| 2.8.2 qRT-PCR检测刺激后SeAtg5基因表达量的变化 | 第37页 |
| 2.9 原核表达 | 第37-41页 |
| 2.9.1 扩增Atg5开放阅读框 | 第37-38页 |
| 2.9.2 构建pET32α(+)-Atg5重组质粒 | 第38页 |
| 2.9.3 重组质粒pET32α(+)-Atg5转化表达菌株 | 第38-39页 |
| 2.9.4 重组蛋白表达条件的探索 | 第39-40页 |
| 2.9.5 重组蛋白大量表达 | 第40页 |
| 2.9.6 重组蛋白的纯化 | 第40-41页 |
| 2.10 多克隆抗体的制备 | 第41-42页 |
| 2.11 Western blot检测抗体特异性及分析甜菜夜蛾SeATG5在虫体的表达特征 | 第42-44页 |
| 3. 结果与分析 | 第44-61页 |
| 3.1 甜菜夜蛾SeAtg5基因全长的获得与序列分析 | 第44-50页 |
| 3.1.1 甜菜夜蛾蛹总RNA的提取 | 第44页 |
| 3.1.2 甜菜夜蛾SeAtg5基因保守片段的克隆 | 第44-45页 |
| 3.1.3 RACE-PCR扩增甜菜夜蛾SeAtg5基因的全长 | 第45-46页 |
| 3.1.4 序列分析和系统进化分析 | 第46-50页 |
| 3.2 甜菜夜蛾SeAtg5基因时空表达模式分析 | 第50-52页 |
| 3.3 病毒刺激后SeAtg5基因表达量的变化 | 第52-53页 |
| 3.4 原核表达纯化SeATG5重组蛋白 | 第53-55页 |
| 3.4.1 重组质粒pET32α(+)-SeAtg5的构建 | 第53页 |
| 3.4.2 SeATG5重组蛋白的表达与纯化 | 第53-54页 |
| 3.4.3 Western blot检测SeATG5的表达特征 | 第54-55页 |
| 3.5 二化螟CsAtg5基因全长的获得与序列分析 | 第55-58页 |
| 3.5.1 二化螟蛹总RNA的提取 | 第55-56页 |
| 3.5.2 二化螟CsAtg5基因保守片段的克隆 | 第56页 |
| 3.5.3 RACE-PCR扩增二化螟CsAtg5基因的全长 | 第56-58页 |
| 3.5.4 序列分析 | 第58页 |
| 3.6 二化螟CsAtg5基因时空表达分析 | 第58-59页 |
| 3.7 原核表达纯化CsATG5重组蛋白 | 第59-60页 |
| 3.8 二化螟CsATG5抗体的制备结果 | 第60-61页 |
| 4. 讨论 | 第61-64页 |
| 4.1 甜菜夜蛾和二化螟Atg5基因的序列分析和进化分析 | 第61-62页 |
| 4.2 甜菜夜蛾和二化螟中Atg5的功能分析 | 第62-64页 |
| 4.2.1 Atg5基因在甜菜夜蛾和二化螟变态发育过程的重要作用 | 第62页 |
| 4.2.2 SeATG5在甜菜夜蛾抗病毒感染过程中的作用 | 第62页 |
| 4.2.3 SeATG5可能介导甜菜夜蛾高水平自噬到凋亡的转换 | 第62-63页 |
| 4.2.4 二化螟处于不良环境条件时Atg基因的功能分析 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-70页 |
| 附录 | 第70-73页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74页 |
