| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 一、前言 | 第13-17页 |
| 1.1 植物应答低磷胁迫调节机理的研究进展 | 第13-14页 |
| 1.1.1 MYB基因家族 | 第13-14页 |
| 1.1.2 WRKY家族 | 第14页 |
| 1.2 植物抗逆境信号过程中的调节基因 | 第14-16页 |
| 1.3 立题依据及本研究的意义 | 第16-17页 |
| 二、实验材料 | 第17-21页 |
| 2.1 植物材料 | 第17页 |
| 2.2 菌种、载体 | 第17页 |
| 2.3 实验室所用的工具酶 | 第17页 |
| 2.4 化学试剂及其它材料 | 第17页 |
| 2.5 常用储存液 | 第17页 |
| 2.6 常用培养基 | 第17-19页 |
| 2.7 原核蛋白表达及纯化所用试剂及缓冲液 | 第19-20页 |
| 2.8 EMSA实验所用试剂及缓冲液 | 第20页 |
| 2.9 仪器设备 | 第20-21页 |
| 三、实验方法 | 第21-31页 |
| 3.1 拟南芥的无菌培养及收取 | 第21页 |
| 3.2 拟南芥RNA的提取、消化及逆转录反应 | 第21-22页 |
| 3.3 PCR检测逆转录的cDNA完整性 | 第22页 |
| 3.4 基因的表达分析 | 第22-24页 |
| 3.5 AtCBL1基因的启动子的分析 | 第24-27页 |
| 3.5.1 AtCBL1启动子的分离 | 第24-25页 |
| 3.5.2 AtCBL1启动子测序与序列分析 | 第25-26页 |
| 3.5.3 AtCBL1P：GUS融合表达载体的构建 | 第26-27页 |
| 1) 目的片段和载体的双酶切及连接 | 第26页 |
| 2) 连接产物转化大肠杆菌与重组转化子的菌落检测 | 第26页 |
| 3) 碱裂解法小量提取质粒 | 第26页 |
| 4) 重组质粒的检测 | 第26-27页 |
| 3.5.4 pBI101-AtCBL1P转基因拟南芥的筛选、鉴定及胁迫处理 | 第27页 |
| 3.6 AtCBL1过量表达转基因拟南芥、T-DNA突变体功能分析 | 第27-29页 |
| 3.6.1 AtCBL1克隆及过量表达载体的构建 | 第27-28页 |
| 3.6.2 AtCBL1过量表达转基因拟南芥的筛选、鉴定与表达分析 | 第28页 |
| 3.6.3 拟南芥T-DNA插入突变体cbl1的鉴定 | 第28页 |
| 3.6.4 AtCBL1过量表达转基因拟南芥、cbl1突变体植株表型分析 | 第28页 |
| 3.6.5 低磷胁迫相关基因在转基因和突变体拟南芥中的表达分析 | 第28-29页 |
| 3.7 低磷应答中CBL1相互作用CIPK的筛选鉴定 | 第29页 |
| 3.7.1 酵母双杂交载体构建 | 第29页 |
| 3.7.2 酵母感受态细胞的制备及酵母转化 | 第29页 |
| 3.7.3 pGBKT7-AtCIPK17融合蛋白的自激活及毒性检测 | 第29页 |
| 3.7.4 酵母mating实验 | 第29页 |
| 3.8 PHR1、WRKY75与AtCBL1启动子相互作用分析 | 第29-30页 |
| 3.8.1 pET28-PHR1、pMAL-WRKY75原核表达载体的构建 | 第29页 |
| 3.8.2 BL21感受态细胞的制备 | 第29-30页 |
| 3.8.3 PHR1、WRKY75蛋白表达 | 第30页 |
| 3.8.4 PHR1、WRKY75蛋白纯化(小量纯化) | 第30页 |
| 3.8.6 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白 | 第30页 |
| 3.9 PHR1、WRKY75与AtCBL1启动子相互作用分析 | 第30-31页 |
| 四、结果与分析 | 第31-43页 |
| 4.1 AtCBL1基因的克隆 | 第31页 |
| 4.2 AtCBL1基因的表达模式分析 | 第31-32页 |
| 4.3 AtCBL1基因启动子分析 | 第32-34页 |
| 4.3.1 AtCBL1基因启动子克隆 | 第32页 |
| 4.3.2 AtCBL1P：GUS融合构建及拟南芥转化 | 第32-33页 |
| 4.3.3 AtCBL1启动子低磷胁迫活性变化分析 | 第33-34页 |
| 4.4 AtCBL1过量表达转基因拟南芥表型分析 | 第34-37页 |
| 4.4.1 AtCBL1过量表达载体的构建、拟南芥转化及鉴定 | 第34-35页 |
| 4.4.2 AtCBL1过量表达转基因拟南芥表型分析 | 第35-36页 |
| 4.4.3 AtCBL1过量表达转基因拟南芥中低磷应答相关基因表达分析 | 第36-37页 |
| 4.5 cbl1突变体鉴定及其表型分析 | 第37-39页 |
| 4.5.1 拟南芥cbl1突变体鉴定 | 第37页 |
| 4.5.2 突变体拟南芥幼苗发育早期的表型分析 | 第37-38页 |
| 4.5.3 突变体拟南芥中下游磷相关基因的表达分析 | 第38-39页 |
| 4.6 AtCBL1和AtCIPK17相互作用分析 | 第39-41页 |
| 4.6.1 AtCBL1与AtCIPK17酵母双杂交分析 | 第39-40页 |
| 4.6.2 AtCBLl与AtCIPK17双分子荧光互补（BiFC)分析 | 第40-41页 |
| 4.7 AtCBL1上游调控因子的分析 | 第41-43页 |
| 五、讨论 | 第43-45页 |
| 5.1. AtCBL1的启动子活性受到低磷和激素的诱导 | 第43页 |
| 5.2 AtCBL1过量表达增强了转基因拟南芥对低磷的耐受性 | 第43-44页 |
| 5.3 AtCBL1蛋白与其靶蛋白AtCIPK17相互作用响应磷饥饿反应 | 第44页 |
| 5.4 AtCBL1蛋白与上游调控因子WRKY75相互作用响应磷饥饿反应 | 第44-45页 |
| 参考文献 | 第45-49页 |
| 硕士期间参与发表的论文 | 第49-50页 |
| 附录Ⅰ | 第50-51页 |
| 附录Ⅱ | 第51-52页 |
| 致谢 | 第52-53页 |
