| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-21页 |
| 1.1 毕赤酵母表达系统 | 第11-12页 |
| 1.1.1 毕赤酵母表达系统发展简介 | 第11-12页 |
| 1.1.2 毕赤酵母表达系统的发展优势 | 第12页 |
| 1.2 毕赤酵母AOX基因的调控 | 第12-16页 |
| 1.2.1 毕赤酵母的甲醇利用途径 | 第12-14页 |
| 1.2.2 毕赤酵母AOX基因简介 | 第14页 |
| 1.2.3 毕赤酵母AOX1启动子的调控模型 | 第14页 |
| 1.2.4 毕赤酵母AOX1启动子的顺式调控元件 | 第14-15页 |
| 1.2.5 毕赤酵母AOX1启动子甲醇诱导相关转录因子 | 第15-16页 |
| 1.3 酵母中碳源阻遏机制及相关的基因 | 第16-17页 |
| 1.3.1 酵母中碳源阻遏机制 | 第16页 |
| 1.3.2 酵母中碳源阻遏机制的相关基因 | 第16-17页 |
| 1.4 蛋白质与DNA相互作用的分析方法 | 第17-19页 |
| 1.4.1 电泳迁移阻滞实验(EMSA) | 第18-19页 |
| 1.4.2 DNase I footprinting analysis实验 | 第19页 |
| 1.5 研究背景、内容及意义 | 第19-21页 |
| 第2章 毕赤酵母AOX1动子的转录因子异源表达 | 第21-29页 |
| 2.1 前言 | 第21页 |
| 2.2 实验材料 | 第21-22页 |
| 2.2.1 菌株、质粒和试剂 | 第21页 |
| 2.2.2 培养基和常用缓冲溶液 | 第21-22页 |
| 2.3 实验方法 | 第22-24页 |
| 2.3.1 毕赤酵母GS115菌株基因组的提取 | 第22页 |
| 2.3.2 毕赤酵母AOX1启动子转录因子异源表达质粒的构建 | 第22-23页 |
| 2.3.3 重组蛋白表达质粒在大肠杆菌中的表达 | 第23页 |
| 2.3.4 SDS-PAGE蛋白电泳分析 | 第23-24页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第24-28页 |
| 2.4.1 毕赤酵母AOX1启动子的转录因子在大肠杆菌中的异源表达 | 第24-25页 |
| 2.4.2 转录因子的锌指结构域在大肠杆菌中的异源表达 | 第25-28页 |
| 2.5 本章小结 | 第28-29页 |
| 第3章 转录因子异源表达诱导条件优化及蛋白纯化 | 第29-37页 |
| 3.1 前言 | 第29页 |
| 3.2 实验材料 | 第29页 |
| 3.2.1 菌株、质粒和试剂 | 第29页 |
| 3.2.2 常用溶液和培养基的配制 | 第29页 |
| 3.3 实验方法 | 第29-32页 |
| 3.3.1 毕赤酵母AOX1启动子转录调控因子异源表达的诱导时间优化 | 第29-30页 |
| 3.3.2 转录因子异源表达的诱导温度优化 | 第30页 |
| 3.3.3 转录因子异源表达的IPTG诱导剂量优化 | 第30页 |
| 3.3.4 重组蛋白的镍柱分离纯化 | 第30-31页 |
| 3.3.6 蛋白透析 | 第31页 |
| 3.3.7 Bradford法蛋白定量 | 第31-32页 |
| 3.4 实验结果 | 第32-36页 |
| 3.4.1 毕赤酵母AOX1启动子的转录因子异源表达的诱导条件优化 | 第32-34页 |
| 3.4.2 毕赤酵母AOX1启动子转录因子异源表达的蛋白纯化 | 第34-35页 |
| 3.4.3 Bradford法蛋白定量测定蛋白浓度 | 第35-36页 |
| 3.5 本章小结 | 第36-37页 |
| 第4章 转录因子与AOX1启动子相互作用的研究 | 第37-46页 |
| 4.1 前言 | 第37页 |
| 4.2 实验材料 | 第37-38页 |
| 4.2.1 菌株、试剂 | 第37页 |
| 4.2.2 常用溶液配制 | 第37-38页 |
| 4.3 实验方法 | 第38-40页 |
| 4.3.1 AOX1启动子的序列分析及分段扩增 | 第38页 |
| 4.3.2 非变性蛋白电泳凝胶的配制 | 第38页 |
| 4.3.3 转录因子和DNA的结合反应 | 第38页 |
| 4.3.4 非变性蛋白电泳 | 第38页 |
| 4.3.5 溴化乙啶(EB)染色法EMSA实验 | 第38-39页 |
| 4.3.6 化学发光法EMSA实验 | 第39-40页 |
| 4.3.7 荧光标记法EMSA实验 | 第40页 |
| 4.4 实验结果 | 第40-44页 |
| 4.4.1 AOX1启动子序列分段扩增 | 第40页 |
| 4.4.2 转录因子与AOX1启动子的EMSA实验 | 第40-42页 |
| 4.4.3 转录因子Prm1与MIT1启动子及PRM1启动子的EMSA实验 | 第42-44页 |
| 4.5 本章小结 | 第44-46页 |
| 第5章 转录因子与AOX1启动子结合位点的鉴定 | 第46-53页 |
| 5.1 前言 | 第46页 |
| 5.2 实验材料 | 第46页 |
| 5.2.1 菌株和试剂 | 第46页 |
| 5.2.2 溶液配制 | 第46页 |
| 5.3 实验方法 | 第46-47页 |
| 5.3.1 DNase I footprinting analysis实验的探针制备 | 第46页 |
| 5.3.2 DNase I footprinting analysis实验 | 第46-47页 |
| 5.4 实验结果 | 第47-52页 |
| 5.4.1 FAM荧光标记探针的制备 | 第47页 |
| 5.4.2 转录因子Prm1与AOX1启动子结合位点的鉴定 | 第47-48页 |
| 5.4.3 转录因子Nrg1与AOX1启动子结合位点的鉴定 | 第48-50页 |
| 5.4.4 转录因子Mit1与AOX1启动子结合位点的鉴定 | 第50-52页 |
| 5.5 本章小结 | 第52-53页 |
| 第6章 结论与展望 | 第53-55页 |
| 6.1 结论 | 第53-54页 |
| 6.2 展望 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-59页 |
| 致谢 | 第59页 |
