| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 中英文对照和缩略语表 | 第15-17页 |
| 1 绪论 | 第17-42页 |
| 1.1 引言 | 第17页 |
| 1.2 无细胞蛋白表达体系研究进展 | 第17-22页 |
| 1.2.1 不同物种无细胞体系的比较 | 第17-19页 |
| 1.2.2 无细胞蛋白表达技术关键突破 | 第19-20页 |
| 1.2.3 无细胞体外表达蛋白的折叠 | 第20-21页 |
| 1.2.4 高通量微型化无细胞蛋白表达系统 | 第21-22页 |
| 1.3 无细胞蛋白表达系统的应用 | 第22-29页 |
| 1.3.1 无细胞蛋白表达系统在生物制药中的应用 | 第22-26页 |
| 1.3.1.1 在蛋白表达时加入特殊氨基酸 | 第22-23页 |
| 1.3.1.2 药物靶标蛋白的高效表达 | 第23-25页 |
| 1.3.1.3 类病毒颗粒的表达 | 第25-26页 |
| 1.3.2 无细胞蛋白表达系统在合成生物学的应用 | 第26-29页 |
| 1.3.2.1 体外编辑遗传线路 | 第26-27页 |
| 1.3.2.2 无细胞体系中的空间效应 | 第27-29页 |
| 1.4 细菌细胞壁 | 第29-36页 |
| 1.4.1 细菌细胞壁的结构与功能 | 第29页 |
| 1.4.2 细胞壁合成途径 | 第29-31页 |
| 1.4.3 细菌细胞壁合成途径的研究意义 | 第31-32页 |
| 1.4.4 作用于细胞壁合成途径的各阶段抑制剂的研究进展 | 第32-36页 |
| 1.5 反义寡核苷酸技术 | 第36-41页 |
| 1.5.1 反义寡核苷酸 | 第37页 |
| 1.5.2 反义寡聚核苷酸设计筛选 | 第37-38页 |
| 1.5.3 反义技术应用在细菌代谢调控中的研究进展 | 第38-41页 |
| 1.6 本论文的主要内容及研究意义 | 第41-42页 |
| 2 材料与方法 | 第42-47页 |
| 2.1 实验材料 | 第42-44页 |
| 2.1.1 质粒 | 第42页 |
| 2.1.2 大肠杆菌菌种 | 第42页 |
| 2.1.3 实验试剂 | 第42页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第42-43页 |
| 2.1.5 培养基 | 第43页 |
| 2.1.6 分子生物学实验溶液配置 | 第43-44页 |
| 2.2 实验方法 | 第44-47页 |
| 2.2.1 大肠杆菌基因组提取 | 第44-45页 |
| 2.2.2 SDS-PAGE电泳 | 第45页 |
| 2.2.3 Western blot分析 | 第45-46页 |
| 2.2.4 蛋白浓度测定 | 第46-47页 |
| 3 胞壁酸合成途径的体外重建 | 第47-70页 |
| 3.1 引言 | 第47-48页 |
| 3.2 材料与方法 | 第48-56页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第48-49页 |
| 3.2.2 实验方法 | 第49-56页 |
| 3.2.2.1 MurA-MurF无细胞表达质粒构建 | 第49-50页 |
| 3.2.2.2 MurA-MurF的无细胞表达反应 | 第50-51页 |
| 3.2.2.3 MurA-MurF的无细胞共表达质粒载体构建 | 第51-54页 |
| 3.2.2.4 PCR产物为模板的MurA-MurF共表达 | 第54页 |
| 3.2.2.5 MurA-MurF的酶活反应体系 | 第54-55页 |
| 3.2.2.6 MurA-MurB酶活的毛细管电泳检测 | 第55-56页 |
| 3.2.2.7 胞壁酸合成途经产物HPLC分析方法 | 第56页 |
| 3.2.2.8 胞壁酸合成途径产物HPLC-ESI-MS分析方法 | 第56页 |
| 3.3 实验结果 | 第56-69页 |
| 3.3.1 MurA-MurF在无细胞系统中的可溶性表达 | 第56-57页 |
| 3.3.2 MurA-MurF在无细胞系统中利用共表达载体实现的多基因表达 | 第57-58页 |
| 3.3.3 PCR为模板的多基因共表达 | 第58-59页 |
| 3.3.4 MurA和MurB反应底物的毛细管电泳分析 | 第59页 |
| 3.3.5 MurA和MurB反应产物的毛细管电泳分析 | 第59-61页 |
| 3.3.6 MurA-MurF反应产物的HPLC分析 | 第61-63页 |
| 3.3.7 MurA和MurB反应产物的HPLC-ESI-MS分析 | 第63-69页 |
| 3.4 本章小结 | 第69-70页 |
| 4 胞壁酸合成途径的反义寡核苷酸设计和抑制作用 | 第70-85页 |
| 4.1 引言 | 第70-72页 |
| 4.2 材料与方法 | 第72-74页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第72页 |
| 4.2.2 实验方法 | 第72-74页 |
| 4.2.2.1 MurA-MurF的mRNA结构预测 | 第72页 |
| 4.2.2.2 反义寡核苷酸无细胞体系功能筛选 | 第72-73页 |
| 4.2.2.3 不同浓度反义寡核苷酸抑制目标蛋白的表达 | 第73页 |
| 4.2.2.4 反义寡核苷酸对胞壁酸合成代谢的影响 | 第73-74页 |
| 4.3 实验结果 | 第74-84页 |
| 4.3.1 MurA-MurF的反义寡核苷酸计算机辅助设计 | 第74-80页 |
| 4.3.2 MurA-MurF的反义寡核苷酸无细胞体系筛选 | 第80-82页 |
| 4.3.3 MurA和MurB的最佳反义寡核苷酸反应浓度无细胞体系筛选以及对代谢流的抑制 | 第82-84页 |
| 4.4 本章小结 | 第84-85页 |
| 5 无细胞体外合成蛋白质体系的改进 | 第85-109页 |
| 5.1 引言 | 第85页 |
| 5.2 材料与方法 | 第85-99页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第85-86页 |
| 5.2.2 溶液配制 | 第86-87页 |
| 5.2.2.1 T7 RNA聚合酶制备溶液 | 第86页 |
| 5.2.2.2 Batch模式无细胞体系溶液配制 | 第86页 |
| 5.2.2.3 CECF模式无细胞体系溶液配制 | 第86-87页 |
| 5.2.3 实验方法 | 第87-99页 |
| 5.2.3.1 肌酸激酶、丙酮酸酸激酶、T7 RNA聚合酶的基因扩增 | 第87-88页 |
| 5.2.3.2 CK以及T7 RNA聚合酶共表达质粒pETDuet-CK-T7质粒载体构建 | 第88-90页 |
| 5.2.3.3 T7 RNA聚合酶和CK共表达菌株构建 | 第90-91页 |
| 5.2.3.4 Batch模式大肠杆菌S30抽提物制备 | 第91页 |
| 5.2.3.5 Batch模式无细胞蛋白表达体系配置 | 第91-92页 |
| 5.2.3.6 自制Batch模式无细胞蛋白表达系统与商业化系统比较 | 第92-93页 |
| 5.2.3.7 丙酮酸激酶表达质粒pET28a-PK构建 | 第93-94页 |
| 5.2.3.8 丙酮酸激酶的制备 | 第94-95页 |
| 5.2.3.9 T7 RNA聚合酶的制备 | 第95-96页 |
| 5.2.3.10 CECF模式大肠杆菌S30抽提物制备 | 第96-97页 |
| 5.2.3.11 CECF模式无细胞反应器设计制作 | 第97-98页 |
| 5.2.3.12 CECF模式无细胞体系配置 | 第98-99页 |
| 5.3 实验结果 | 第99-108页 |
| 5.3.1 肌酸激酶与T7 RNA聚合酶共表达质粒构建 | 第99-101页 |
| 5.3.2 肌酸激酶与T7 RNA聚合酶在E.coli BL21(DE3)中共表达 | 第101-102页 |
| 5.3.3 Batch模式无细胞体系构建 | 第102-104页 |
| 5.3.4 丙酮酸激酶的表达 | 第104-106页 |
| 5.3.5 CECF无细胞体系构建 | 第106-108页 |
| 5.4 本章小结 | 第108-109页 |
| 6 总结与展望 | 第109-112页 |
| 6.1 总结 | 第109-110页 |
| 6.2 展望 | 第110-112页 |
| 参考文献 | 第112-122页 |
| 附录 | 第122-128页 |
| 个人简历 | 第128页 |
