| 摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-28页 |
| 1 弓形虫病原的发现史与分类 | 第13页 |
| 2 弓形虫主要基因及其表达的蛋白 | 第13-25页 |
| 2.1 弓形虫表面抗原(SURFACE ANTIGEN,SAG) | 第14-17页 |
| 2.1.1 SAG1(P30)基因及其表达的蛋白 | 第14-15页 |
| 2.1.2 SAG2(P22)基因及其表达的蛋白 | 第15页 |
| 2.1.3 SAG3(P43)基因及其表达的蛋白 | 第15-16页 |
| 2.1.4 SAG4(P18)基因及其表达的蛋白 | 第16页 |
| 2.1.5 SAG5基因及其表达的蛋白 | 第16-17页 |
| 2.2 弓形虫致密颗粒蛋白(DENSE GRANULES ANTIGEN,GRA) | 第17-19页 |
| 2.2.1 GRA1基因及其表达的蛋白 | 第17页 |
| 2.2.2 GRA2基因及其表达的蛋白 | 第17-18页 |
| 2.2.3 GRA3基因及其表达的蛋白 | 第18页 |
| 2.2.4 GRA4基因及其表达的蛋白 | 第18页 |
| 2.2.5 GRA5基因及其表达的蛋白 | 第18页 |
| 2.2.6 GRA6基因及其表达的蛋白 | 第18-19页 |
| 2.2.7 GRA7基因及其表达的蛋白 | 第19页 |
| 2.2.8 GRA8基因及其表达的蛋白 | 第19页 |
| 2.3 弓形虫的微线体蛋白(MICRONEME PROTEIN,MIC) | 第19-23页 |
| 2.3.1 TgMIC1基因及其表达的蛋白 | 第20页 |
| 2.3.2 TgMIC2基因及其表达的蛋白 | 第20-21页 |
| 2.3.3 TgMIC3基因及其表达的蛋白 | 第21页 |
| 2.3.4 TgMIC4基因及其表达的蛋白 | 第21页 |
| 2.3.5 TgMIC5基因及其表达的蛋白 | 第21-22页 |
| 2.3.6 TgMIC6-9基因及其表达的蛋白 | 第22-23页 |
| 2.3.7 TgMIC10基因及其表达的蛋白 | 第23页 |
| 2.3.8 TgMIC11基因及其表达的蛋白 | 第23页 |
| 2.4、弓形虫的棒状体蛋白(RHOPTRY PROTEIN,ROP) | 第23-25页 |
| 2.4.1 ROP1基因及其表达的蛋白 | 第23-24页 |
| 2.4.2 ROP2家族 | 第24-25页 |
| 3 弓形虫分子生物学诊断方法的新进展 | 第25-28页 |
| 3.1 核酸探针技术 | 第25页 |
| 3.2 PCR技术 | 第25-28页 |
| 3.2.1 普通PCR | 第25-26页 |
| 3.2.2 聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP) | 第26页 |
| 3.2.3 聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP) | 第26-27页 |
| 3.2.4 原位PCR(In Situ PCR,IS-PCR) | 第27页 |
| 3.2.5 巢式PCR(Nested PCR) | 第27页 |
| 3.2.6 实时定量PCR(real-time quantitative PCR) | 第27-28页 |
| 第二章 弓形虫三重SYBRGREEN Ⅰ实时荧光定量PCR的建立及其应用检测 | 第28-53页 |
| 1 材料与方法 | 第28-38页 |
| 1.1 材料 | 第28-30页 |
| 1.1.1 虫株、菌株、试验动物与样本 | 第28页 |
| 1.1.2 主要的试剂盒 | 第28页 |
| 1.1.3 主要的试剂 | 第28-29页 |
| 1.1.4 主要溶液的配制 | 第29-30页 |
| 1.1.5 主要的仪器 | 第30页 |
| 1.2 方法 | 第30-38页 |
| 1.2.1 弓形虫体外培养 | 第30-31页 |
| 1.2.2 引物的设计与合成 | 第31页 |
| 1.2.3 DNA的提取 | 第31-32页 |
| 1.2.4 PCR扩增 | 第32页 |
| 1.2.5 琼脂糖凝胶DNA回收操作步骤 | 第32-33页 |
| 1.2.6 目的基因的克隆 | 第33-35页 |
| 1.2.7 RealtimePCR标准品的建立 | 第35-37页 |
| 1.2.8 ITS-1、529bp和B1三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立 | 第37页 |
| 1.2.9 样品检测 | 第37-38页 |
| 2. 结果及分析 | 第38-51页 |
| 2.1 弓形虫速殖子复苏,纯化 | 第38页 |
| 2.2 PCR扩增结果 | 第38-39页 |
| 2.3 重组质粒的鉴定结果 | 第39-43页 |
| 2.3.1 重组质粒的双酶切和PCR | 第39-41页 |
| 2.3.2 重组质粒测序结果 | 第41-43页 |
| 2.4 REAL-TIME PCR标准品的构建 | 第43-46页 |
| 2.4.1 重组质粒拷贝数的定量 | 第43页 |
| 2.4.2 SYBR Green Ⅰ PCR real-time PCR扩增 | 第43-45页 |
| 2.4.3 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR重复性 | 第45-46页 |
| 2.5 B1、529BP和ITS-1三重SYBRGREEN Ⅰ荧光定量PCR检测体系的建立 | 第46-49页 |
| 2.5.1 三重SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR溶解曲线的绘制和特异性试验 | 第46页 |
| 2.5.2 三重SYBRGreen Ⅰ real-time PCR敏感性试验 | 第46-48页 |
| 2.5.3 三重SYBRGreen Ⅰ real-time PCR重复性试验 | 第48-49页 |
| 2.6 福州屠宰场采集猪血样检测 | 第49-51页 |
| 3 讨论 | 第51-53页 |
| 第三章 弓形虫截短SAG2基因的克隆、表达和ELISA方法的建立 | 第53-70页 |
| 1 材料与方法 | 第53-62页 |
| 1.1 材料 | 第53-56页 |
| 1.1.1 虫株、载体、样本及菌株 | 第53页 |
| 1.1.2 主要的试剂盒 | 第53-54页 |
| 1.1.3 主要的试剂 | 第54页 |
| 1.1.4 主要的试剂配制 | 第54-56页 |
| 1.1.5 主要的仪器 | 第56页 |
| 1.2 方法 | 第56-62页 |
| 1.2.1 截短SAG2基因克隆 | 第56-58页 |
| 1.2.2 重组蛋白rSAG2t的诱导表达、纯化、透析和鉴定 | 第58-61页 |
| 1.2.3 重组蛋白rSAG2t间接ELISA检测方法的建立 | 第61-62页 |
| 2. 结果及分析 | 第62-68页 |
| 2.1 截短SAG2的扩增 | 第62页 |
| 2.2 重组质粒的酶切鉴定 | 第62-63页 |
| 2.3 重组质粒测序鉴定 | 第63-64页 |
| 2.4 重组蛋白RSAG2T的表达、纯化 | 第64页 |
| 2.5 重组蛋白的WESTERN BLOTTING分析 | 第64-65页 |
| 2.6 重组抗原、血清的最佳工作浓度 | 第65页 |
| 2.7 特异性试验与ELISA临界值的确定 | 第65-67页 |
| 2.8 重复性试验 | 第67页 |
| 2.9 与商品化试剂盒检测结果的比较 | 第67-68页 |
| 3 讨论 | 第68-70页 |
| 结论 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
| 附表1 | 第83-85页 |
| 附图1 | 第85-86页 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 | 第86页 |
