| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-32页 |
| 1.1 酯酶 | 第14-19页 |
| 1.1.1 酯类水解酶 | 第14页 |
| 1.1.2 酯酶的来源与分类 | 第14-17页 |
| 1.1.3 酯酶的结构特征与催化机理 | 第17-19页 |
| 1.1.3.1 酯酶的结构特征 | 第17-18页 |
| 1.1.3.2 酯酶的催化机理 | 第18-19页 |
| 1.1.4 酯酶的立体选择性在手性药物制备中的应用 | 第19页 |
| 1.2 普瑞巴林概述 | 第19-21页 |
| 1.2.1 普瑞巴林简介 | 第19-21页 |
| 1.2.2 普瑞巴林的市场前景及研究意义 | 第21页 |
| 1.3 普瑞巴林的制备方法及研究进展 | 第21-29页 |
| 1.3.1 化学法制备普瑞巴林 | 第21-25页 |
| 1.3.1.1 化学不对称合成法 | 第21-24页 |
| 1.3.1.2 外消旋体化学拆分法 | 第24-25页 |
| 1.3.2 外消旋体生物拆分法制备普瑞巴林 | 第25-29页 |
| 1.3.2.1 对二腈类衍生物的生物拆分 | 第25-26页 |
| 1.3.2.2 对氰基取代二酯类衍生物的生物拆分 | 第26-29页 |
| 1.4 本课题的研究思路和内容 | 第29-32页 |
| 第二章 ESTZF172的基因克隆及表达 | 第32-58页 |
| 2.1 前言 | 第32页 |
| 2.2 材料与方法 | 第32-38页 |
| 2.2.1 质粒与菌种 | 第32-33页 |
| 2.2.2 实验仪器 | 第33-34页 |
| 2.2.3 主要药品与试剂 | 第34-36页 |
| 2.2.4 试剂与培养基配制 | 第36-38页 |
| 2.3 实验方法 | 第38-48页 |
| 2.3.1 Pseudomonas CGMCC No.4184基因文库的构建 | 第38-41页 |
| 2.3.1.1 Pseudomonas CGMCC No.4184全基因组的提取 | 第38页 |
| 2.3.1.2 质粒的提取 | 第38页 |
| 2.3.1.3 E. coli DH5α超级感受态细胞的制备 | 第38-39页 |
| 2.3.1.4 超级感受态细胞转化效率验证 | 第39页 |
| 2.3.1.5 基因组文库构建 | 第39-41页 |
| 2.3.2 阳性克隆子的筛选与检测 | 第41-42页 |
| 2.3.3 目标酯酶基因的确定 | 第42-44页 |
| 2.3.3.1 目标片段PCR扩增 | 第42-43页 |
| 2.3.3.2 表达载体的构建 | 第43-44页 |
| 2.3.3.3 重组工程菌拆分活性的检测 | 第44页 |
| 2.3.4 estZF172基因的克隆与可溶表达 | 第44-46页 |
| 2.3.4.1 estZF172基因的克隆 | 第44页 |
| 2.3.4.2 表达载体的构建 | 第44-45页 |
| 2.3.4.3 estZF172基因的可溶表达 | 第45页 |
| 2.3.4.4 SDS-PAGE凝胶电泳检测表达结果 | 第45-46页 |
| 2.3.5 酯酶EstZF172的活性测定 | 第46-48页 |
| 2.3.5.1 对硝基苯酚酯水解法测定酶活力 | 第46页 |
| 2.3.5.2 CNDE水解法测定酶活力 | 第46-47页 |
| 2.3.5.3 针对目标底物拆分能力的鉴定 | 第47-48页 |
| 2.3.6 分析方法 | 第48页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第48-57页 |
| 2.4.1 目的基因的筛选与克隆 | 第48-54页 |
| 2.4.1.1 全基因组的提取 | 第48-49页 |
| 2.4.1.2 全基因组的部分酶切 | 第49-50页 |
| 2.4.1.3 含酯酶基因转化子的筛选和验证 | 第50-52页 |
| 2.4.1.4 目标基因片段的筛选与确定 | 第52-54页 |
| 2.4.2 EstZF172相应的基因克隆及蛋白表达 | 第54-57页 |
| 2.4.2.1 estZF172基因的克隆 | 第54-55页 |
| 2.4.2.2 表达载体的构建及鉴定 | 第55-56页 |
| 2.4.2.3 EstZF172蛋白的表达 | 第56页 |
| 2.4.2.4 EstZF172活性验证 | 第56-57页 |
| 2.4.2.5 estZF172基因序列提交 | 第57页 |
| 2.5 本章小结 | 第57-58页 |
| 第三章 ESTZF172的序列分析及酶学性质表征 | 第58-81页 |
| 3.1 前言 | 第58页 |
| 3.2 材料与方法 | 第58-60页 |
| 3.2.1 菌种 | 第58-59页 |
| 3.2.2 实验仪器 | 第59页 |
| 3.2.3 主要药品与试剂 | 第59-60页 |
| 3.2.4 试剂配制 | 第60页 |
| 3.2.5 分子生物学软件与网络资源 | 第60页 |
| 3.3 实验方法 | 第60-64页 |
| 3.3.1 基因与蛋白质序列分析 | 第60-61页 |
| 3.3.2 定点突变验证 | 第61-62页 |
| 3.3.3 蛋白质的纯化 | 第62页 |
| 3.3.4 EstZF172酶学性质研究 | 第62-64页 |
| 3.3.4.1 底物特异性 | 第62-63页 |
| 3.3.4.2 温度对酯酶的影响 | 第63页 |
| 3.3.4.3 pH对酯酶的影响 | 第63页 |
| 3.3.4.4 添加剂对酯酶的影响 | 第63-64页 |
| 3.3.4.5 酯酶的反应动力学参数测定 | 第64页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第64-79页 |
| 3.4.1 estZF172基因开放阅读框及相关核苷酸片段分析 | 第64-65页 |
| 3.4.2 酯酶EstZF172的纯化 | 第65-66页 |
| 3.4.3 酯酶EstZF172序列同源性分析 | 第66-68页 |
| 3.4.4 同源建模 | 第68-71页 |
| 3.4.5 定点突变与分子对接验证 | 第71-74页 |
| 3.4.6 酯酶EstZF172的酶学性质表征 | 第74-79页 |
| 3.4.6.1 酯酶的底物特异性 | 第74页 |
| 3.4.6.2 温度对酯酶活力的影响 | 第74-75页 |
| 3.4.6.3 pH对酯酶活力的影响 | 第75-77页 |
| 3.4.6.4 添加剂对酯酶活力的影响 | 第77-79页 |
| 3.4.6.5 酯酶的动力学参数 | 第79页 |
| 3.5 本章小结 | 第79-81页 |
| 第四章 重组全细胞水解制备(S)-CNDE的工艺研究 | 第81-103页 |
| 4.1 前言 | 第81页 |
| 4.2 材料与方法 | 第81-82页 |
| 4.2.1 菌种 | 第81页 |
| 4.2.2 实验仪器 | 第81-82页 |
| 4.2.3 主要药品与试剂 | 第82页 |
| 4.3 实验方法 | 第82-86页 |
| 4.3.1 酯酶EstZF172表达条件优化 | 第82-83页 |
| 4.3.2 最适转化温度及pH测定 | 第83页 |
| 4.3.3 底物自水解程度的测定 | 第83页 |
| 4.3.4 不同温度条件下的半衰期 | 第83-84页 |
| 4.3.5 全细胞载量的确定 | 第84页 |
| 4.3.6 固定底物/细胞载量比例下不同浓度底物的转化 | 第84页 |
| 4.3.7 底物和产物抑制影响测定 | 第84页 |
| 4.3.8 产物抑制解除方案探究 | 第84-85页 |
| 4.3.8.1 金属离子对产物抑制的解除作用 | 第84-85页 |
| 4.3.8.2 阴离子交换树脂对产物抑制的解除作用 | 第85页 |
| 4.3.9 底物/细胞载量比例的优化 | 第85-86页 |
| 4.3.10 气相分析方法 | 第86页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第86-102页 |
| 4.4.1 酯酶的产酶条件优化 | 第86-89页 |
| 4.4.1.1 诱导强度的影响 | 第86-87页 |
| 4.4.1.2 诱导时机的影响 | 第87页 |
| 4.4.1.3 诱导温度的影响 | 第87页 |
| 4.4.1.4 诱导时间的影响 | 第87-89页 |
| 4.4.2 转化过程温度和pH的选择 | 第89-92页 |
| 4.4.2.1 转化过程的最适温度和pH | 第89-90页 |
| 4.4.2.2 转化温度与pH的确定 | 第90-92页 |
| 4.4.3 全细胞用量的确定 | 第92-93页 |
| 4.4.4 固定底物/细胞载量比例下不同浓度底物的转化 | 第93-94页 |
| 4.4.5 底物、产物浓度对全细胞转化的影响 | 第94-95页 |
| 4.4.6 产物抑制解除测试 | 第95-100页 |
| 4.4.6.1 金属离子添加对产物抑制的解除效果 | 第95-96页 |
| 4.4.6.2 阴离子树脂添加对产物抑制的解除效果 | 第96-100页 |
| 4.4.7 高底物浓度下全细胞载量的优化 | 第100-102页 |
| 4.5 本章小结 | 第102-103页 |
| 第五章 结论与展望 | 第103-105页 |
| 5.1 结论 | 第103-104页 |
| 5.2 展望 | 第104-105页 |
| 参考文献 | 第105-111页 |
| 附录 | 第111-116页 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 | 第116页 |
