| 摘要 | 第11-15页 |
| ABSTRACT | 第15-19页 |
| 缩略语表 | 第20-23页 |
| 第一章 文献综述 | 第23-62页 |
| 1 前言 | 第23-24页 |
| 2 脂肪组织的功能 | 第24-27页 |
| 2.1 脂肪是重要的畜禽经济性状 | 第24-25页 |
| 2.2 脂肪与肥胖及其相关代谢疾病密切相关 | 第25-27页 |
| 3 脂肪组织的发育 | 第27-28页 |
| 4 脂肪生成的细胞学事件与分子调控 | 第28-43页 |
| 4.1 MSCs成脂定向与分子调控 | 第28-33页 |
| 4.1.1 胞外信号分子 | 第29-31页 |
| 4.1.2 转录因子 | 第31页 |
| 4.1.3 转录共因子 | 第31-33页 |
| 4.2 有丝分裂克隆性扩增与分子调控 | 第33-36页 |
| 4.2.1 转录因子 | 第34-36页 |
| 4.2.2 转录共因子 | 第36页 |
| 4.3 白色脂肪细胞终末分化与分子调控 | 第36-41页 |
| 4.3.1 调控白色脂肪细胞分化的转录因子 | 第37-39页 |
| 4.3.2 调控白色脂肪细胞分化的转录共因子 | 第39-41页 |
| 4.4 棕色脂肪细胞终末分化与分子调控 | 第41-43页 |
| 4.4.1 调控棕色脂肪细胞分化的转录因子 | 第41-42页 |
| 4.4.2 调控棕色脂肪细胞分化的转录共因子 | 第42-43页 |
| 5 锌指蛋白对脂肪生成的调控研究 | 第43-49页 |
| 5.1 锌指蛋白及其分类 | 第43-44页 |
| 5.2 锌指蛋白对脂肪生成的调控 | 第44-49页 |
| 5.2.1 锌指蛋白调控脂肪细胞分化 | 第45-47页 |
| 5.2.2 锌指蛋白调控早期成脂定向 | 第47-49页 |
| 6 锌指蛋白Bcl6 的研究进展 | 第49-58页 |
| 6.1 Bcl6 的结构特征 | 第49-50页 |
| 6.2 Bcl6 的功能研究 | 第50-58页 |
| 6.2.1 Bcl6 是一个抑癌基因 | 第50-51页 |
| 6.2.2 Bcl6 是一个转录调控因子 | 第51-52页 |
| 6.2.3 Bcl6 调控的生物过程及相关靶基因 | 第52-55页 |
| 6.2.4 Bcl6 的相互作用蛋白研究 | 第55-58页 |
| 7 研究转录因子调控脂肪生成的关键技术 | 第58-61页 |
| 7.1 高通量测序筛选新的成脂转录因子 | 第58页 |
| 7.2 功能“缺失”和“获得”研究转录因子调控脂肪生成 | 第58-60页 |
| 7.2.1 靶基因敲低或敲除技术 | 第58-59页 |
| 7.2.2 靶基因的过表达技术 | 第59-60页 |
| 7.3 活体水平研究转录因子调控脂肪生成 | 第60-61页 |
| 7.3.1 构建转基因小鼠模型 | 第60页 |
| 7.3.2 裸鼠的前体细胞移植 | 第60-61页 |
| 8 课题研究的目的意义 | 第61-62页 |
| 第二章 猪Rb1 基因的克隆、表达模式及调控脂肪生成的功能研究 | 第62-83页 |
| 1 前言 | 第62-63页 |
| 2 材料和方法 | 第63-72页 |
| 2.1 实验材料 | 第63页 |
| 2.1.1 动物、细胞和细菌材料 | 第63页 |
| 2.1.2 质粒和载体 | 第63页 |
| 2.2 主要仪器、试剂和溶液的配制 | 第63-66页 |
| 2.2.1 主要仪器 | 第63-64页 |
| 2.2.2 主要试剂与试剂盒 | 第64-65页 |
| 2.2.3 试剂配制 | 第65-66页 |
| 2.3 实验方法 | 第66-72页 |
| 2.3.1 组织采样 | 第66页 |
| 2.3.2 猪Rb1 基因分子克隆和序列分析 | 第66-67页 |
| 2.3.3 猪成熟脂肪细胞的分离和DFAT细胞的获得 | 第67页 |
| 2.3.4 流式细胞仪检测原代DFAT细胞表面抗原 | 第67-68页 |
| 2.3.5 总RNA提取、纯化和反转录 | 第68-69页 |
| 2.3.6 定量Real time PCR（QPCR） | 第69页 |
| 2.3.7 细胞总蛋白抽提及Western blot检测 | 第69-70页 |
| 2.3.8 siRNA细胞转染和成脂诱导 | 第70-71页 |
| 2.3.9 油红O染色 | 第71页 |
| 2.3.10 双荧光素酶活性检测 | 第71页 |
| 2.3.11 统计分析 | 第71-72页 |
| 3 结果与分析 | 第72-81页 |
| 3.1 猪Rb1 基因的克隆、序列分析与组织表达谱 | 第72-75页 |
| 3.1.1 猪Rb1 基因CDS序列的克隆 | 第72页 |
| 3.1.2 猪Rb1 序列分析与生物进化树构建 | 第72-75页 |
| 3.1.3 猪Rb1 基因组织表达谱 | 第75页 |
| 3.2 Rb1 调控猪DFAT细胞成脂定向分化的功能研究 | 第75-81页 |
| 3.2.1 猪DFAT细胞的分离、表面抗原鉴定与多向分化 | 第75-77页 |
| 3.2.2 Rb1 在猪DFAT细胞成脂定向分化过程的表达模式 | 第77页 |
| 3.2.3 siRNA敲低Rb1 对猪DFAT细胞成脂定向分化的影响 | 第77-79页 |
| 3.2.4 siRNA敲低Rb1 对猪DFAT细胞成脂定向分化过程白色和棕色脂肪标志基因表达的影响 | 第79-80页 |
| 3.2.5 siRNA敲低Rb1 对细胞周期关键基因表达和E2F活性的影响 | 第80-81页 |
| 4 讨论 | 第81-83页 |
| 4.1 Rb1 在DFAT细胞成脂早期下调表达且负调控白色脂肪生成 | 第81-82页 |
| 4.2 Rb1 通过E2F介导来影响DFAT细胞成脂定向分化 | 第82-83页 |
| 第三章 靶定新的锌指蛋白Bcl6 及其调控干细胞成脂定向的功能研究 | 第83-127页 |
| 1 前言 | 第83-84页 |
| 2 材料与方法 | 第84-93页 |
| 2.1 材料 | 第84-87页 |
| 2.1.1 动物、细胞和细菌材料 | 第84页 |
| 2.1.2 载体和质粒 | 第84页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第84-85页 |
| 2.1.4 主要试剂与试剂盒 | 第85-86页 |
| 2.1.5 试剂配制 | 第86-87页 |
| 2.2 实验方法 | 第87-93页 |
| 2.2.1 基因的克隆和表达质粒的构建 | 第87-88页 |
| 2.2.2 干涉质粒的构建 | 第88页 |
| 2.2.3 原代细胞分离与培养 | 第88页 |
| 2.2.4 细胞转染和成脂诱导 | 第88-89页 |
| 2.2.5 油红O染色 | 第89页 |
| 2.2.6 脂肪细胞甘油三酯含量测定 | 第89页 |
| 2.2.7 总RNA提取、纯化和反转录 | 第89页 |
| 2.2.8 QPCR | 第89页 |
| 2.2.9 总蛋白抽提及Western blot检测 | 第89-90页 |
| 2.2.10 流式细胞仪检测细胞周期 | 第90页 |
| 2.2.11 EdU染色 | 第90页 |
| 2.2.12 转录因子结合位点预测 | 第90-91页 |
| 2.2.13 RNAi靶序列设计 | 第91-92页 |
| 2.2.14 裸鼠皮下干细胞移植 | 第92页 |
| 2.2.15 脂肪组织H&E染色 | 第92页 |
| 2.2.16 统计分析 | 第92-93页 |
| 3 结果与分析 | 第93-125页 |
| 3.1 靶定新的锌指蛋白Bcl6 | 第93-98页 |
| 3.1.1 候选转录因子的筛选及其对靶基因的结合预测 | 第93-94页 |
| 3.1.2 QPCR验证候选TFs在成脂早期的表达模式 | 第94-95页 |
| 3.1.3 siRNA干涉候选差异转录因子对SV细胞成脂定向分化表型的影响 | 第95-98页 |
| 3.2 猪Bcl6 基因的克隆、序列分析与表达规律 | 第98-103页 |
| 3.2.1 猪Bcl6 基因CDS序列克隆 | 第98-99页 |
| 3.2.2 各物种Bcl6 序列比对及生物进化树构建 | 第99-101页 |
| 3.2.3 猪Bcl6 的表达规律研究 | 第101-103页 |
| 3.3 Bcl6 调控猪原代SV细胞成脂定向分化的功能研究 | 第103-107页 |
| 3.3.1 敲低Bcl6 对猪SV细胞周期的影响 | 第103-105页 |
| 3.3.2 Bcl6 对猪SV细胞成脂定向分化的影响 | 第105-106页 |
| 3.3.3 敲低Bcl6 对成脂关键基因mRNA表达的影响 | 第106-107页 |
| 3.4 小鼠Bcl6 的表达规律研究 | 第107-112页 |
| 3.4.1 小鼠Bcl6 的组织表达谱 | 第107-108页 |
| 3.4.2 Bcl6 在小鼠不同成脂能力的成纤维细胞中的表达情况 | 第108-109页 |
| 3.4.3 Bcl6 在小鼠间充质干细胞系C3H10T1/2 细胞成脂定向分化过程的表达模式 | 第109-112页 |
| 3.5 Bcl6 调控脂肪生成的功能研究 | 第112-123页 |
| 3.5.1 Bcl6 调控小鼠干细胞增殖的作用研究 | 第112-116页 |
| 3.5.2 Bcl6 调控小鼠干细胞成脂定向分化的功能研究 | 第116-120页 |
| 3.5.3 敲低或过表达Bcl6 对成脂关键基因表达的影响 | 第120-122页 |
| 3.5.4 过表达PPARγ 对C3H10T1/2 细胞敲低Bcl6 成脂分化的挽救 | 第122-123页 |
| 3.6 体内研究Bcl6 对脂肪生成的调控作用 | 第123-125页 |
| 4 讨论 | 第125-127页 |
| 4.1 Bcl6 在干细胞分化过程抑制增殖 | 第125页 |
| 4.2 Bcl6 是干细胞成脂定向所必需的关键因子 | 第125-127页 |
| 第四章 Bcl6 调控干细胞成脂定向的分子机制 | 第127-173页 |
| 1 前言 | 第127-128页 |
| 2 材料和方法 | 第128-138页 |
| 2.1 试验材料 | 第128-129页 |
| 2.1.1 动物、细胞和细菌材料 | 第128页 |
| 2.1.2 载体和质粒 | 第128-129页 |
| 2.2 主要仪器、试剂和溶液的配制 | 第129-132页 |
| 2.2.1 主要仪器 | 第129页 |
| 2.2.2 主要试剂和试剂盒 | 第129-131页 |
| 2.2.3 主要溶液的配制 | 第131-132页 |
| 2.3 试验方法 | 第132-138页 |
| 2.3.1 干涉和过表达Bcl6 的C3H10T1/2 稳定细胞系的建立 | 第132-133页 |
| 2.3.2 测序样品收集与总RNA抽提 | 第133页 |
| 2.3.3 cDNA文库的构建和HiSeq 2500 平台的测序 | 第133-134页 |
| 2.3.4 DEGs的筛选 | 第134页 |
| 2.3.5 QPCR验证测序结果 | 第134-135页 |
| 2.3.6 基因的功能注释 | 第135页 |
| 2.3.7 转录因子结合位点的分析 | 第135页 |
| 2.3.8 基因组DNA的抽提 | 第135页 |
| 2.3.9 基因的克隆和表达质粒的构建 | 第135-136页 |
| 2.3.10 启动子截短报告载体的构建 | 第136页 |
| 2.3.11 siRNA靶序列设计 | 第136页 |
| 2.3.12 细胞转染 | 第136页 |
| 2.3.13 成脂诱导的方式 | 第136页 |
| 2.3.14 脂滴的染色 | 第136-137页 |
| 2.3.15 总RNA抽提、纯化及反转录 | 第137页 |
| 2.3.16 QPCR | 第137页 |
| 2.3.17 总蛋白抽提及Western blot检测 | 第137页 |
| 2.3.18 双荧光素酶活性检测 | 第137页 |
| 2.3.19 染色质免疫沉淀和免疫沉淀 | 第137-138页 |
| 2.3.20 统计分析 | 第138页 |
| 3 结果与分析 | 第138-169页 |
| 3.1 RNA-seq筛选Bcl6 调控的靶基因 | 第138-147页 |
| 3.1.1 干涉和过表达Bcl6 的C3H10T1/2 稳定细胞系建立 | 第138-140页 |
| 3.1.2 RNA-seq测序结果 | 第140-144页 |
| 3.1.3 筛选Bcl6 调控脂肪生成过程的靶基因 | 第144-147页 |
| 3.2 Bcl6 靶基因对C3H10T1/2 细胞成脂定向分化的调控 | 第147-153页 |
| 3.2.1 生物信息学预测Bcl6 对候选靶基因启动子的结合 | 第147-148页 |
| 3.2.2 调控MSCs成脂定向的Bcl6 靶基因筛选 | 第148-150页 |
| 3.2.3 敲低STAT1 对C3H10T1/2 细胞成脂定向分化的影响 | 第150-152页 |
| 3.2.4 敲低Nmi对C3H10T1/2 细胞成脂定向分化的影响 | 第152-153页 |
| 3.3 Bcl6 对靶基因STAT1 和Nmi的调控关系 | 第153-161页 |
| 3.3.1 敲低或过表达Bcl6 对STAT1 和Nmi表达的影响 | 第153页 |
| 3.3.2 Bcl6 及其靶基因STAT1 和Nmi在Bcl6 KD C3H10T1/2 细胞成脂定向过程的mRNA表达模式 | 第153-156页 |
| 3.3.3 Bcl6 及其靶基因STAT1 和Nmi在高脂日粮诱导的肥胖小鼠脂肪组织中的表达模式 | 第156-158页 |
| 3.3.4 Bcl6 对STAT1 基因启动子结合的研究 | 第158-159页 |
| 3.3.5 启动子活性试验研究Bcl6 对STAT1 的结合 | 第159-161页 |
| 3.4 STAT1 对敲低Bcl6 调控C3H10T1/2 细胞成脂能力的挽救 | 第161-162页 |
| 3.5 Bcl6 调控C3H10T1/2 细胞成脂定向分化的关键结构域研究 | 第162-169页 |
| 3.5.1 Bcl6 结构域截短表达载体的构建和表达 | 第162-164页 |
| 3.5.2 Bcl6 结构域截短对C3H10T1/2 细胞成脂定向的影响 | 第164-166页 |
| 3.5.3 Bcl6 不同结构域截短对STAT1 基因和蛋白表达的影响 | 第166-167页 |
| 3.5.4 Bcl6 与Ebf1 相互作用调控干细胞成脂定向 | 第167-169页 |
| 4 讨论 | 第169-173页 |
| 4.1 STAT1 是Bcl6 调控干细胞成脂定向过程的关键靶基因 | 第169-171页 |
| 4.2 Bcl6 调控干细胞成脂定向与靶基因表达依赖于PEST和ZF结构域 | 第171-173页 |
| 第五章 结语 | 第173-174页 |
| 1 研究结论 | 第173页 |
| 2 创新点 | 第173页 |
| 3 本研究不足之处 | 第173-174页 |
| 参考文献 | 第174-198页 |
| 附录I | 第198-205页 |
| 附录II 研究生期间发表的文章 | 第205-206页 |
| 致谢 | 第206-208页 |
