| 中文摘要 | 第10-13页 |
| Abstract | 第13-16页 |
| 1 前言 | 第17-29页 |
| 1.1 植物雄性不育 | 第17-19页 |
| 1.1.1 高等植物雄配子体的发育过程 | 第17-18页 |
| 1.1.2 花药绒毡层细胞的功能 | 第18-19页 |
| 1.2 绒毡层程序性细胞死亡 | 第19-23页 |
| 1.2.1 绒毡层程序性细胞死亡的发现 | 第19-20页 |
| 1.2.2 绒毡层程序性细胞死亡的分子调控网络 | 第20-23页 |
| 1.3 ROS与绒毡层PCD | 第23-25页 |
| 1.3.1 ROS的来源 | 第24页 |
| 1.3.2 ROS介导细胞信号的分子机制 | 第24页 |
| 1.3.3 ROS参与绒毡层PCD | 第24-25页 |
| 1.4 植物NADPH氧化酶 | 第25-27页 |
| 1.4.1 植物NADPH氧化酶的功能 | 第25-26页 |
| 1.4.2 NADPH氧化酶活性的调节机制 | 第26-27页 |
| 1.5 研究目的与意义 | 第27-29页 |
| 2 材料与方法 | 第29-45页 |
| 2.1 材料 | 第29页 |
| 2.1.1 植物材料及生长条件 | 第29页 |
| 2.1.2 酶与各种生化试剂 | 第29页 |
| 2.2 方法 | 第29-45页 |
| 2.2.1 构建表达载体 | 第29-33页 |
| 2.2.1.1 设计PCR引物 | 第29-30页 |
| 2.2.1.2 PCR扩增目的基因 | 第30页 |
| 2.2.1.3 回收PCR产物 | 第30-31页 |
| 2.2.1.4 构建克隆载体 | 第31页 |
| 2.2.1.5 大肠杆菌转化及质粒提取（试剂盒法） | 第31-33页 |
| 2.2.1.6 DNA序列测定 | 第33页 |
| 2.2.1.7 LR反应 | 第33页 |
| 2.2.1.8 质粒DNA的酶切鉴定 | 第33页 |
| 2.2.2 拟南芥遗传转化及植物材料的鉴定 | 第33-35页 |
| 2.2.2.1 制备农杆菌感受态与转化 | 第33-34页 |
| 2.2.2.2 拟南芥的种植和遗传转化 | 第34页 |
| 2.2.2.3 提取植物基因组DNA | 第34-35页 |
| 2.2.2.4 双突变体的获得及鉴定 | 第35页 |
| 2.2.3 qRT-PCR | 第35-37页 |
| 2.2.3.1 引物设计与合成 | 第36页 |
| 2.2.3.2 提取植物总RNA | 第36页 |
| 2.2.3.3 反转录 | 第36-37页 |
| 2.2.3.4 qRT-PCR | 第37页 |
| 2.2.4 GUS染色 | 第37页 |
| 2.2.5 石蜡切片 | 第37-38页 |
| 2.2.5.1 取材 | 第38页 |
| 2.2.5.2 石蜡包埋 | 第38页 |
| 2.2.5.3 脱蜡及钌红染色 | 第38页 |
| 2.2.6 原位杂交分析 | 第38-41页 |
| 2.2.6.1 固定材料 | 第38页 |
| 2.2.6.2 包埋 | 第38-39页 |
| 2.2.6.3 切片 | 第39页 |
| 2.2.6.4 原位探针标记 | 第39-40页 |
| 2.2.6.5 杂交预处理 | 第40页 |
| 2.2.6.6 杂交 | 第40-41页 |
| 2.2.6.7 洗片 | 第41页 |
| 2.2.6.8 检测 | 第41页 |
| 2.2.7 花粉萌发及花粉染色实验 | 第41-42页 |
| 2.2.7.1 花粉萌发实验 | 第41-42页 |
| 2.2.7.2 亚历山大染色实验 | 第42页 |
| 2.2.7.3 DAPI染色实验 | 第42页 |
| 2.2.8 扫描电子显微镜观察 | 第42页 |
| 2.2.9 树脂切片观察 | 第42-43页 |
| 2.2.10透射电子显微镜观察 | 第43页 |
| 2.2.11 TUNEL检测绒毡层PCD | 第43-44页 |
| 2.2.12 NBT染ROS和H2DCF-DA荧光染ROS | 第44-45页 |
| 3 结果与分析 | 第45-65页 |
| 3.1 拟南芥RBOHE的表达模式 | 第45-46页 |
| 3.1.1 启动子连接报告基因分析RBOHE的表达模式 | 第45页 |
| 3.1.2 RNA原位杂交分析RBOHE的表达模式 | 第45-46页 |
| 3.2 拟南芥RBOHE功能缺失突变体表型分析 | 第46-52页 |
| 3.2.1 RBOHE功能缺失突变体的鉴定 | 第46-50页 |
| 3.2.1.1 分离及转录水平鉴定RBOHE功能缺失突变体 | 第46-47页 |
| 3.2.1.2 rbohe突变体果荚结实率下降 | 第47页 |
| 3.2.1.3 rbohe突变体花粉萌发率降低，花粉大量败育 | 第47-49页 |
| 3.2.1.4 透射电镜实验显示rbohe突变体花粉壁缺陷造成花粉败育 | 第49-50页 |
| 3.2.2 rbohe突变花粉败育，是孢子体缺陷造成的 | 第50-52页 |
| 3.2.2.1 rbohe杂合突变体花粉无明显败育，花粉萌发率正常。 | 第50页 |
| 3.2.2.2 树脂切片和透射电镜实验显示rbohe突变体绒毡层细胞降解推迟 | 第50-52页 |
| 3.3 RBOHE和RBOHC在绒毡层细胞中功能冗余 | 第52-54页 |
| 3.3.1 RBOHC在花药绒毡层中时空特异性表达 | 第52页 |
| 3.3.2 RBOHE与RBOHC在花药中功能冗余 | 第52-54页 |
| 3.4 过表达RBOHE导致植物雄性不育 | 第54-58页 |
| 3.4.1 Osg6B启动子表达模式分析 | 第54页 |
| 3.4.2 过表达RBOHE转基因植株转录水平鉴定 | 第54页 |
| 3.4.3 过表达RBOHE转基因植株表型分析 | 第54-57页 |
| 3.4.4 过表达RBOHE导致绒毡层细胞降解提前 | 第57-58页 |
| 3.5 RBOHE功能缺失和过表达都会干扰绒毡层PCD时间 | 第58页 |
| 3.6 RBOH通过产生ROS调控绒毡层PCD时间 | 第58-60页 |
| 3.7 RBOHE的表达分别受关键转录因子AMS正调控和MYB80负调控 | 第60-65页 |
| 3.7.1 RBOHE在突变体ams和myb80中的表达变化 | 第60-61页 |
| 3.7.1.1 荧光定量PCR结果显示RBOHE在ams突变体花药中表达量降低，在myb80突变体花药中的表达量升高 | 第61页 |
| 3.7.1.2 启动子连接报告基因检测结果显示RBOHE在ams突变体花药中表达量降低，在myb80突变体花药中表达量升高 | 第61页 |
| 3.7.1.3 RNA原位杂交检测结果显示RBOHE在ams突变体绒毡层中表达量降低，在myb80突变体绒毡层中表达量升高 | 第61页 |
| 3.7.2 myb80/rbohe双突变体部分恢复myb80突变体绒毡层PCD提前的表型 | 第61-65页 |
| 3.7.2.1 树脂切片和透射电镜实验结果显示myb80/rbohe双突变体绒毡层降解延迟 | 第61-62页 |
| 3.7.2.2 TUNEL实验结果显示myb80/rbohe双突变体绒毡层PCD延迟 | 第62-65页 |
| 4 讨论 | 第65-68页 |
| 5 结论 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第76页 |
