| 中文摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 符号说明 | 第14-16页 |
| 第一部分 文献综述 | 第16-63页 |
| 第一章 溶栓药物与人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)及其重组突变体的研究进展 | 第16-35页 |
| 1 血栓的概述 | 第16-17页 |
| 1.1 血栓的形成 | 第16-17页 |
| 1.2 溶栓机理 | 第17页 |
| 2 溶栓药物及其市场发展前景 | 第17-24页 |
| 2.1 溶栓药物的发展历程 | 第17-22页 |
| 2.2 溶栓药物的市场发展前景 | 第22-24页 |
| 3 人组织纤溶酶原激活剂的概述 | 第24-29页 |
| 3.1 概念及溶栓原理 | 第24-25页 |
| 3.2 人组织纤溶酶原激活剂的发展简史 | 第25-27页 |
| 3.3 人组织纤溶酶原激活剂的结构与功能分析 | 第27-29页 |
| 4 重组突变体人组织纤溶酶原激活剂的研究 | 第29-34页 |
| 4.1 国外的研究情况 | 第29-33页 |
| 4.2 国内的研究情况 | 第33-34页 |
| 5 问题与展望 | 第34-35页 |
| 第二章 转基因动物乳腺生物反应器的研究进展 | 第35-42页 |
| 1 乳腺生物反应器的概述 | 第35-36页 |
| 2 乳腺生物反应器的转基因技术 | 第36-39页 |
| 2.1 逆转录病毒载体法(retrovirus-mediated gene transfer) | 第36页 |
| 2.2 原始生殖细胞介导法(primordial germ cells,PGCs) | 第36-37页 |
| 2.3 精子载体法(sperm mediated gene transfer) | 第37页 |
| 2.4 胚胎干细胞技术(embryonic stem cell,ESC) | 第37页 |
| 2.5 体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transplantation,SCNT) | 第37-38页 |
| 2.6 显微原核注射法(pronuclear microinjection) | 第38-39页 |
| 3 乳腺生物反应器的目标动物选择 | 第39页 |
| 4 乳腺生物反应器的应用 | 第39-41页 |
| 4.1 转基因动物乳腺生物反应器模型的建立 | 第39页 |
| 4.2 改善乳汁成分,提高其营养价值 | 第39-40页 |
| 4.3 生产(重组)医药蛋白 | 第40页 |
| 4.4 利用乳腺生物反应器生产t-PA及其重组突变体 | 第40-41页 |
| 5 展望与问题 | 第41-42页 |
| 第三章 乳蛋白分离纯化的研究进展 | 第42-53页 |
| 1 蛋白分离纯化的概述 | 第42-44页 |
| 1.1 一般蛋白的分离纯化 | 第42-43页 |
| 1.2 乳腺生物反应器生产重组蛋白的分离纯化 | 第43-44页 |
| 2 乳蛋白常用分离纯化技术(层析技术) | 第44-51页 |
| 2.1 反相层析(Reversed phase chromatography,RPC) | 第44-45页 |
| 2.2 疏水层析(Hydrophobic interaction chromatography,HIC) | 第45页 |
| 2.3 离子交换层析(Ion exchange chromatography,IEC) | 第45-46页 |
| 2.4 凝胶过滤层析(Gel filtration chromatography,GFC) | 第46-48页 |
| 2.5 亲和层析(Affinity chromatography,AC) | 第48-51页 |
| 3 t-PA及其重组突变体的分离纯化 | 第51-52页 |
| 4 问题与展望 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-63页 |
| 第二部分 研究内容 | 第63-178页 |
| 前言 | 第63-64页 |
| 第一章 乳腺特异性表达rhPA基因载体的构建 | 第64-79页 |
| 1 材料 | 第64-66页 |
| 1.1 菌种及质粒 | 第64页 |
| 1.2 主要仪器 | 第64-65页 |
| 1.3 分子生物学试剂 | 第65页 |
| 1.4 主要试剂的配制 | 第65-66页 |
| 1.5 DNA分析软件 | 第66页 |
| 2 方法 | 第66-73页 |
| 2.1 常规分子生物学的操作方法 | 第66页 |
| 2.2 质粒酶切反应 | 第66页 |
| 2.3 酶切产物的回收 | 第66-67页 |
| 2.4 连接反应 | 第67-68页 |
| 2.5 重组人纤溶酶原激活剂(rhPA)基因的PCR扩增与克隆 | 第68-70页 |
| 2.6 乳腺特异性表达载体PCL25/rhPA的构建 | 第70-71页 |
| 2.7 乳腺特异性表达载体BLC14/rhPA的构建 | 第71-72页 |
| 2.8 乳腺特异性表达载体AP/rhPA的构建 | 第72-73页 |
| 2.9 PCR检测插入rhPA基因片段的正反向 | 第73页 |
| 3 结果 | 第73-77页 |
| 3.1 PCR扩增产物rhPA的T-A克隆 | 第73-74页 |
| 3.2 载体PCL25/rhPA的构建 | 第74-75页 |
| 3.3 载体BLC14/rhPA的构建 | 第75-76页 |
| 3.4 载体AP/rhPA的构建 | 第76-77页 |
| 4 讨论 | 第77-79页 |
| 第二章 重组人纤溶酶原激活剂(rhPA)乳腺特异性表达载体在山羊乳腺上皮细胞(GMECs)中的初步验证 | 第79-93页 |
| 1 材料 | 第79-81页 |
| 1.1 实验动物 | 第79页 |
| 1.2 主要器械与仪器 | 第79-80页 |
| 1.3. 主要试剂 | 第80页 |
| 1.4 主要试剂的配制 | 第80-81页 |
| 2 方法 | 第81-85页 |
| 2.1 山羊乳腺上皮细胞分离和培养 | 第81-83页 |
| 2.2 外源基因电转染山羊乳腺上皮细胞及筛选 | 第83-84页 |
| 2.3 抗性细胞株的PCR整合检测 | 第84-85页 |
| 2.4 山羊乳腺上皮细胞诱导表达rhPA的检测 | 第85页 |
| 3 结果 | 第85-91页 |
| 3.1 乳腺上皮细胞的分离纯化培养及生长特点 | 第85-87页 |
| 3.2 转基因乳腺上皮细胞单克隆细胞株的获得 | 第87-89页 |
| 3.3 ELISA检测乳腺上皮细胞诱导rhPA表达 | 第89-90页 |
| 3.4 FAPA检测诱导液体外溶栓活性 | 第90-91页 |
| 4 讨论 | 第91-93页 |
| 第三章 rhPA转基因免的制备及其乳腺表达特性分析 | 第93-120页 |
| 1 材料 | 第94-97页 |
| 1.1 实验动物 | 第94页 |
| 1.2 主要仪器 | 第94页 |
| 1.3 主要器材 | 第94-95页 |
| 1.4 主要试剂及药品 | 第95页 |
| 1.5 主要试剂配制 | 第95-97页 |
| 2 方法 | 第97-108页 |
| 2.1 基因的准备 | 第97-99页 |
| 2.2 转rhPA基因免的制备 | 第99-103页 |
| 2.3 转基因免的整合检测 | 第103-104页 |
| 2.4 转基因兔乳腺表达产物分析 | 第104-106页 |
| 2.5 转基因免的传代及纯合子培育 | 第106-107页 |
| 2.6 荧光定量PCR检测转基因免的拷贝数 | 第107-108页 |
| 3 结果 | 第108-118页 |
| 3.1 显微注射基因片段的回收 | 第108页 |
| 3.2 转基因兔的获得与传代 | 第108-111页 |
| 3.3 转基因免乳清的E LISA检测结果 | 第111-113页 |
| 3.4 转基因免乳清的SDS-PAGE电泳和Western Blot检测结果 | 第113-114页 |
| 3.5 体外溶栓检测结果 | 第114-116页 |
| 3.6 Real-time PCR结果 | 第116-118页 |
| 4 讨论 | 第118-120页 |
| 第四章 rhPA单克隆抗体的制备及筛选 | 第120-142页 |
| 1 材料 | 第121-124页 |
| 1.1 实验动物 | 第121页 |
| 1.2 细胞株/系 | 第121页 |
| 1.3 主要器材 | 第121页 |
| 1.4 主要试剂及药品 | 第121-122页 |
| 1.5 主要试剂配制 | 第122-124页 |
| 2 方法 | 第124-132页 |
| 2.1 动物免疫 | 第124-125页 |
| 2.2 细胞融合过程 | 第125-127页 |
| 2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选 | 第127-128页 |
| 2.4 杂交瘤细胞株的克隆化 | 第128页 |
| 2.5 杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 | 第128页 |
| 2.6 杂交瘤细胞株的特异性鉴定、稳定性分析及建株 | 第128-129页 |
| 2.7 PR-mAb的筛选 | 第129页 |
| 2.8 rhPA单克隆抗体的大量制备 | 第129-132页 |
| 3 结果 | 第132-140页 |
| 3.1 两种不同方法的免疫小鼠血清效价检测结果 | 第132-133页 |
| 3.2 两种不同方法的细胞融合结果 | 第133页 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞的筛选 | 第133-135页 |
| 3.4 阳性杂交瘤细胞的亚克隆(克隆化)及稳定性 | 第135页 |
| 3.5 杂交瘤细胞株的建立及其分泌抗体特异性检测 | 第135-136页 |
| 3.6 PR-mAb的筛选结果 | 第136页 |
| 3.7 腹水的制备及效价测定 | 第136-138页 |
| 3.8 腹水抗体的纯化及鉴定 | 第138页 |
| 3.9 纯化抗体效价浓度和特异性反应结果 | 第138-140页 |
| 4 讨论 | 第140-142页 |
| 第五章 转基因免乳中rhPA的分离纯化及鉴定 | 第142-165页 |
| 1 材料 | 第143-146页 |
| 1.1 乳原料 | 第143页 |
| 1.2 主要器材 | 第143页 |
| 1.3 主要试剂及药品 | 第143-144页 |
| 1.4 主要试剂配制 | 第144-146页 |
| 2 方法 | 第146-153页 |
| 2.1 转基因兔乳前处理 | 第146-148页 |
| 2.2 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rhPA | 第148-150页 |
| 2.3 凝胶过滤法进一步精纯 | 第150页 |
| 2.4 双向电泳鉴定纯化产物 | 第150-152页 |
| 2.5 飞行时间质谱鉴定纯化产物 | 第152-153页 |
| 2.6 圆二色谱分析纯化产物的二级结构 | 第153页 |
| 2.7 FAPA测定纯化产物(rhPA)的比活性 | 第153页 |
| 3 结果 | 第153-162页 |
| 3.1 乳样前处理的结果 | 第153-154页 |
| 3.2 亲和层析柱的制备 | 第154-155页 |
| 3.3 亲和层析洗脱条件优化结果 | 第155-156页 |
| 3.4 凝胶过滤不同上样体积优化结果 | 第156-158页 |
| 3.5 纯化产物的初步鉴定 | 第158-159页 |
| 3.6 双向电泳的结果与分析 | 第159-160页 |
| 3.7 飞行时间质谱与圆二色谱结果 | 第160-161页 |
| 3.8 纯化产物rhPA的比活性计算 | 第161-162页 |
| 4 讨论 | 第162-165页 |
| 第六章血栓模型与溶栓动物试验 | 第165-173页 |
| 1 材料 | 第165-166页 |
| 1.1 实验动物 | 第165页 |
| 1.2 主要仪器和材料 | 第165-166页 |
| 1.3 主要试剂和药品 | 第166页 |
| 2 方法 | 第166-168页 |
| 2.1 纯化产物去除内毒素 | 第166页 |
| 2.2 内毒素检测 | 第166-167页 |
| 2.3 血栓动物模型的制备 | 第167页 |
| 2.4 溶栓动物试验 | 第167-168页 |
| 3 结果 | 第168-171页 |
| 3.1 去内毒素及检测结果 | 第168页 |
| 3.2 血栓模型制备结果 | 第168-169页 |
| 3.3 溶栓动物试验结果 | 第169-171页 |
| 4 讨论 | 第171-173页 |
| 参考文献 | 第173-178页 |
| 第三部分 全文结论与创新点 | 第178-180页 |
| 附录 | 第180-183页 |
| 致谢 | 第183-184页 |
| 攻读学位期间公开发表的学术论文 | 第184-186页 |
