| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 第一篇 文献综述 猪流行性腹泻研究进展 | 第11-29页 |
| 1 猪流行性腹泻概述 | 第11页 |
| 2 PEDV的分类及形态 | 第11-13页 |
| 3 PEDV的理化特性 | 第13页 |
| 4 PEDV的细胞培养特性 | 第13-14页 |
| 5 PED的致病机理与病理变化 | 第14页 |
| 6 PEDV的基因组结构和蛋白 | 第14-17页 |
| 6.1 复制酶基因与复制酶多聚蛋白1ab | 第15页 |
| 6.2 S基因与S(纤突)蛋白 | 第15页 |
| 6.3 ORF3基因与ORF3蛋白 | 第15-16页 |
| 6.4 E基因与E(小膜)蛋白 | 第16页 |
| 6.5 M基因与M(膜)蛋白 | 第16页 |
| 6.6 N基因与N(核衣壳)蛋白 | 第16-17页 |
| 7 PED诊断方法 | 第17-20页 |
| 7.1 病毒的分离与鉴定 | 第17页 |
| 7.2 免疫电镜技术(IEM) | 第17-18页 |
| 7.3 免疫荧光技术(FAT) | 第18页 |
| 7.4 微量血清中和试验 | 第18页 |
| 7.5 酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第18-19页 |
| 7.6 聚合酶链式反应(PCR) | 第19页 |
| 7.7 环介导等温扩增技术(LAMP) | 第19-20页 |
| 8 PED疫苗的研究 | 第20-21页 |
| 8.1 灭活疫苗 | 第20页 |
| 8.2 弱毒疫苗 | 第20-21页 |
| 8.3 基因工程疫苗 | 第21页 |
| 9 研究目的与意义 | 第21-22页 |
| 参考文献 | 第22-29页 |
| 第二篇 研究内容 | 第29-87页 |
| 第一章 2014年上海地区猪流行性腹泻病毒基因变异分析 | 第29-51页 |
| 1 实验材料 | 第30-31页 |
| 1.1 病料来源 | 第30页 |
| 1.2 主要仪器设备 | 第30页 |
| 1.3 主要试剂及试剂盒 | 第30-31页 |
| 2 实验方法 | 第31-34页 |
| 2.1 引物设计与合成 | 第31页 |
| 2.2 病料的处理 | 第31页 |
| 2.3 病毒总RNA的提取 | 第31-32页 |
| 2.4 反转录制备cDNA | 第32-33页 |
| 2.5 PEDVS、M和ORF3基因的PCR扩增 | 第33页 |
| 2.6 电泳 | 第33-34页 |
| 2.7 PCR产物测序 | 第34页 |
| 2.8 基因序列分析比较和进化树的构建 | 第34页 |
| 3 实验结果 | 第34-47页 |
| 3.1 PCR扩增结果 | 第34-35页 |
| 3.2 PEDV S基因序列分析 | 第35-41页 |
| 3.3 PEDV M基因序列分析 | 第41-44页 |
| 3.4 PEDV ORF3基因序列分析 | 第44-47页 |
| 4 讨论 | 第47-49页 |
| 参考文献 | 第49-51页 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达 | 第51-71页 |
| 1 实验材料 | 第51-54页 |
| 1.1 病毒与血清 | 第51-52页 |
| 1.2 质粒与菌种 | 第52页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第52页 |
| 1.4 主要试剂及试剂盒 | 第52页 |
| 1.5 主要缓冲液和培养基的配制 | 第52-54页 |
| 2 实验方法 | 第54-60页 |
| 2.1 引物设计与合成 | 第54-55页 |
| 2.2 目的基因的克隆 | 第55-56页 |
| 2.3 重组表达质粒的构建与鉴定 | 第56-57页 |
| 2.4 重组表达质粒的原核表达 | 第57-60页 |
| 3 实验结果 | 第60-67页 |
| 3.1 目的基因的PCR扩增 | 第60-61页 |
| 3.2 重组质粒pMD-18T-N的PCR鉴定 | 第61-62页 |
| 3.3 重组质粒pMD-18T-N的测序 | 第62页 |
| 3.4 重组原核表达质粒pET-30a-N的双酶切鉴定 | 第62-63页 |
| 3.5 重组原核表达质粒pET-30a-N的测序 | 第63页 |
| 3.6 重组蛋白的诱导表达与SDS-PAGE检测 | 第63-64页 |
| 3.7 重组蛋白表达形式的SDS-PAGE鉴定 | 第64-65页 |
| 3.8 纯化后重组蛋白的SDS-PAGE检测及浓度测定 | 第65-66页 |
| 3.9 重组蛋白的Western-blot鉴定 | 第66-67页 |
| 4 讨论 | 第67-69页 |
| 参考文献 | 第69-71页 |
| 第三章 猪流行性腹泻病毒间接ELISA诊断方法的建立 | 第71-87页 |
| 1 实验材料 | 第71-72页 |
| 1.1 血清 | 第71-72页 |
| 1.2 主要仪器设备 | 第72页 |
| 1.3 主要试剂及试剂盒 | 第72页 |
| 2 实验方法 | 第72-75页 |
| 2.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定 | 第72-73页 |
| 2.2 抗原最佳包被条件的确定 | 第73页 |
| 2.3 最佳封闭液的确定 | 第73页 |
| 2.4 最佳封闭时间的确定 | 第73页 |
| 2.5 待检血清最佳反应时间的确定 | 第73页 |
| 2.6 酶标二抗最佳稀释倍数的确定 | 第73-74页 |
| 2.7 酶标二抗最佳反应时间的确定 | 第74页 |
| 2.8 最佳显色时间的确定 | 第74页 |
| 2.9 阴阳性临界值的确定 | 第74页 |
| 2.10 交叉反应试验 | 第74页 |
| 2.11 敏感性试验 | 第74-75页 |
| 2.12 重复性试验 | 第75页 |
| 2.13 符合率检验 | 第75页 |
| 2.14 临床检测 | 第75页 |
| 3 实验结果 | 第75-82页 |
| 3.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定 | 第75-76页 |
| 3.2 抗原最佳包被条件的确定 | 第76-77页 |
| 3.3 最佳封闭液的确定 | 第77页 |
| 3.4 最佳封闭时间的确定 | 第77页 |
| 3.5 待检血清最佳反应时间的确定 | 第77-78页 |
| 3.6 酶标二抗最佳稀释倍数的确定 | 第78页 |
| 3.7 酶标二抗最佳反应时间的确定 | 第78-79页 |
| 3.8 最佳显色时间的确定 | 第79页 |
| 3.9 阴阳性临界值的确定 | 第79-80页 |
| 3.10 交叉反应试验 | 第80页 |
| 3.11 敏感性试验 | 第80页 |
| 3.12 重复性试验 | 第80-81页 |
| 3.13 符合率检验 | 第81-82页 |
| 3.14 临床检测 | 第82页 |
| 4 讨论 | 第82-84页 |
| 参考文献 | 第84-87页 |
| 全文总结 | 第87-89页 |
| 致谢 | 第89页 |
