| 摘要 | 第3-6页 |
| ABSTRACT | 第6-9页 |
| 第一章 绪论 | 第16-32页 |
| 1.1 肿瘤血管的生成与抑制 | 第16-26页 |
| 1.1.1 肿瘤血管生长因子 | 第18-21页 |
| 1.1.1.1 血管内皮细胞生长因子 | 第18-20页 |
| 1.1.1.2 基质金属蛋白酶 | 第20页 |
| 1.1.1.3 成纤维细胞生长因子 | 第20-21页 |
| 1.1.2 肿瘤血管生长抑制因子 | 第21-26页 |
| 1.1.2.1 肿瘤血管抑制因子的种类 | 第21页 |
| 1.1.2.2 管抑制因子的作用机理 | 第21-25页 |
| 1.1.2.3 管抑制因子Kringle 5 | 第25-26页 |
| 1.1.3 血管生长因子和血管生长抑制因子的关系 | 第26页 |
| 1.2 蛋白受体和配体的筛选及鉴定 | 第26-29页 |
| 1.2.1 酵母双杂交筛选体系 | 第27-28页 |
| 1.2.2 噬菌体展示技术筛选体系 | 第28页 |
| 1.2.3 免疫共沉淀技术 | 第28-29页 |
| 1.3 研究的目的与意义 | 第29页 |
| 1.4 本研究的创新点 | 第29-30页 |
| 1.5 本研究拟采用的技术路线 | 第30-32页 |
| 第二章 KRINGLE 5的原核表达及分离纯化 | 第32-49页 |
| 引言 | 第32页 |
| 2.1 材料与方法 | 第32-40页 |
| 2.1.1 试剂 | 第32-33页 |
| 2.1.2 仪器 | 第33页 |
| 2.1.3 试剂配制 | 第33-35页 |
| 2.1.4 实验方法 | 第35-40页 |
| 2.1.4.1 Kringle 5原核表达载体的构建 | 第35-38页 |
| 2.1.4.2 Kringle 5重组蛋白的表达及分离纯化 | 第38-39页 |
| 2.1.4.3 表达产物的Tris-tricne-SDS-PAGE分析 | 第39-40页 |
| 2.1.4.4 蛋白浓度测定 | 第40页 |
| 2.2 结果与分析 | 第40-47页 |
| 2.2.1 Kringle 5重组载体的构建 | 第40-45页 |
| 2.2.1.1 Kringle 5基因的PCR扩增 | 第40-41页 |
| 2.2.1.2 Kringle 5 PCR产物的胶回收 | 第41页 |
| 2.2.1.3 Kringle 5 PCR产物和pET28b质粒载体的连接及双酶切鉴定 | 第41-43页 |
| 2.2.1.4 Kringle 5重组质粒的测序鉴定 | 第43-45页 |
| 2.2.2 重组菌种的诱导表达 | 第45-47页 |
| 2.2.2.1 重组菌E.Coli BL21(DE3)/ET28b-Kringle 5的表达 | 第45页 |
| 2.2.2.2 重组Kringle 5蛋白的初步分离纯化 | 第45-47页 |
| 2.2.2.3 重组Kringle 5蛋白的凝胶排阻色谱纯化 | 第47页 |
| 2.3 讨论 | 第47-49页 |
| 第三章 噬菌体展示肽库筛选KRINGLE 5结合蛋白 | 第49-64页 |
| 引言 | 第49页 |
| 3.1 材料与方法 | 第49-56页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第49页 |
| 3.1.2 实验仪器 | 第49-50页 |
| 3.1.3 试剂配制 | 第50-51页 |
| 3.1.4 ER2738菌体的复苏 | 第51-52页 |
| 3.1.5 噬菌体滴度测定 | 第52页 |
| 3.1.6 Kringle 5的包被及亲和短肽的筛选 | 第52-54页 |
| 3.1.6.1 第一轮筛选 | 第52-54页 |
| 3.1.6.2 第二轮筛选 | 第54页 |
| 3.1.6.3 第三轮筛选 | 第54页 |
| 3.1.6.4 第四轮筛选 | 第54页 |
| 3.1.7 淘选噬菌斑的扩增及噬菌体的提取 | 第54-55页 |
| 3.1.8 阳性噬菌体基因序列的测定 | 第55页 |
| 3.1.9 ELISA检测Kringle 5蛋白对筛选噬菌体的结合能力 | 第55-56页 |
| 3.2 结果与分析 | 第56-61页 |
| 3.2.1 噬菌体随机肽库的淘选和富集 | 第56-57页 |
| 3.2.2 筛选克隆的测序分析 | 第57-59页 |
| 3.2.3 ELISA分析筛选噬菌体单克隆与Kringle 5的亲和性 | 第59-60页 |
| 3.2.4 蛋白序列比对 | 第60-61页 |
| 3.3 讨论 | 第61-64页 |
| 第四章 分子对接研究KRINGLE 5蛋白与筛选蛋白的作用 | 第64-105页 |
| 引言 | 第64-65页 |
| 4.1 分子对接虚拟筛选药物的基本原理 | 第65-66页 |
| 4.2 蛋白晶体结构的构建 | 第66-69页 |
| 4.2.1 构建晶体模型结构的蛋白氨基酸序列 | 第66-68页 |
| 4.2.2 蛋白3D模型的构建 | 第68-69页 |
| 4.2.3 蛋白三维结构的评价 | 第69页 |
| 4.2.4 Kringle 5蛋白与蛋白的对接研究 | 第69页 |
| 4.3 结果与分析 | 第69-103页 |
| 4.3.1 Kringle 5蛋白的晶体模型构建及评价 | 第69-71页 |
| 4.3.2 VDAC-1蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接研究 | 第71-74页 |
| 4.3.2.1 VDAC-1晶体结构模型的构建 | 第71-72页 |
| 4.3.2.2 VDAC-1与Kringle 5蛋白的分子对接及其活性中心分析 | 第72-74页 |
| 4.3.3 Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor与Kringle 5蛋白的分子对接研究 | 第74-78页 |
| 4.3.3.1 Laminin subunit alpha-3蛋白晶体结构模型的构建 | 第74-76页 |
| 4.3.3.2 Laminin subunit alpha-3蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接及其活性位点分析 | 第76-78页 |
| 4.3.4 ATP-binding cassette sub-family A 12蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接研究 | 第78-82页 |
| 4.3.4.1 ATP-binding cassette sub-family(ABCA12)蛋白晶体结构的构建 | 第78-80页 |
| 4.3.4.2 ABCA12蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接及其活性位点分析 | 第80-82页 |
| 4.3.5 Cochlin precursor蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 | 第82-85页 |
| 4.3.5.1 Cochlin precursor蛋白晶体模型的构建 | 第82-83页 |
| 4.3.5.2 Cochlin precursor蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接及其活性位点分析 | 第83-85页 |
| 4.3.6 Transmembrane channel-like protein 2蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 | 第85-88页 |
| 4.3.6.1 Transmembrane channel-like protein 2蛋白三维结构的构建 | 第85-87页 |
| 4.3.6.2 Transmembrane channel-like protein 2与Kringle 5的分子对接及其活性位点分析 | 第87-88页 |
| 4.3.7 Endothelin B receptor isoform X2与Kringle 5蛋白的分子对接 | 第88-92页 |
| 4.3.7.1 Endothelin B receptor isoform X2蛋白三维结构的构建 | 第88-90页 |
| 4.3.7.2 Endothelin B receptor isoform X2与Kringle 5蛋白的分子对接及活性位点分析 | 第90-92页 |
| 4.3.8 Protein C-ets-2蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 | 第92-95页 |
| 4.3.8.1 Protein C-ets-2蛋白三维模型的构建 | 第92-93页 |
| 4.3.8.2 HEX软件研究Protein C-ets-2蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 | 第93-95页 |
| 4.3.9 Piezo-type mechanosensitive ion channel component 2蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 | 第95-99页 |
| 4.3.9.1 Piezo-type mechanosensitive ion channel component 2蛋白三维模型的构建 | 第95-96页 |
| 4.3.9.2 HEX软件研究Piezo-type mechanosensitive ion channel component 2蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 | 第96-99页 |
| 4.3.10 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 13 isoform 1蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 | 第99-102页 |
| 4.3.10.1 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 13 isoform 1蛋白晶体模型的构建 | 第99-100页 |
| 4.3.10.2 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 13 isoform 1蛋白与Kringle | 第100-102页 |
| 4.3.11 筛选蛋白与Kringle 5蛋白分子对接的自由能分析 | 第102-103页 |
| 4.4 讨论 | 第103-105页 |
| 第五章 VDAC-1蛋白的克隆、表达及纯化工艺研究 | 第105-126页 |
| 引言 | 第105-106页 |
| 5.1 材料与方法 | 第106-114页 |
| 5.1.1 试剂与菌种 | 第106页 |
| 5.1.2 仪器 | 第106-107页 |
| 5.1.3 试剂配制 | 第107-108页 |
| 5.1.4 实验方法 | 第108-114页 |
| 5.1.4.1 VDAC-1原核表达载体的构建 | 第108-110页 |
| 5.1.4.2 VDAC-1重组蛋白的诱导表达及分离纯化 | 第110-113页 |
| 5.1.4.3 SDS-PAGE | 第113-114页 |
| 5.1.4.4 蛋白浓度测定 | 第114页 |
| 5.2 结果与分析 | 第114-124页 |
| 5.2.1 VDAC-1元和表达载体的构建 | 第114-117页 |
| 5.2.1.1 VDAC-1 cDNA的PCR扩增 | 第114-115页 |
| 5.2.1.2 VDAC-1 PCR产物的胶回收 | 第115页 |
| 5.2.1.3 VDAC-1 PCR产物和pET28b质粒载体的双酶切 | 第115-116页 |
| 5.2.1.4 pET28b-VDAC-1重组质粒的测序鉴定 | 第116-117页 |
| 5.2.2 重组E.Co1i BL21(DE3)/pET28b-VDAC-1菌种的诱导表达 | 第117-119页 |
| 5.2.3 重组VDAC-1蛋白的分离纯化 | 第119-123页 |
| 5.2.3.1 重组VDAC-1蛋白的复性后分离 | 第119-121页 |
| 5.2.3.2 重组VDAC-1蛋白的柱上复性 | 第121-123页 |
| 5.2.3.3 两种分离纯化条件对VDAC-1蛋白纯化效率的影响 | 第123页 |
| 5.2.4 不同复性条件对VDAC-1蛋白产率的影响 | 第123-124页 |
| 5.3 讨论 | 第124-126页 |
| 第六章 SPR和前沿色谱法验证KRINGLE 5与VDAC-1相互作用 | 第126-145页 |
| 引言 | 第126页 |
| 6.1 材料与方法 | 第126-127页 |
| 6.1.1 实验材料 | 第126页 |
| 6.1.2 实验仪器及耗材 | 第126-127页 |
| 6.1.2.1 实验仪器 | 第126页 |
| 6.1.2.2 实验耗材 | 第126-127页 |
| 6.2 实验方法 | 第127-131页 |
| 6.2.1 SPR研究Kringle 5蛋白与VDAC-1蛋白的相互作用 | 第127-129页 |
| 6.2.1.1 Kringle 5蛋白固定化最佳条件的确定 | 第127页 |
| 6.2.1.2 Kringle 5蛋白在CM5芯片上的偶联 | 第127页 |
| 6.2.1.3 Kringle 5与VDAC-1蛋白的结合实验 | 第127-128页 |
| 6.2.1.4 VDAC-1与Kringle 5蛋白亲和热力学分析 | 第128页 |
| 6.2.1.5 芯片的再生 | 第128-129页 |
| 6.2.2 前沿色谱法研究Kringle 5蛋白与VDAC-1互作 | 第129-131页 |
| 6.2.2.1 固定化Kringle 5蛋白的硅胶填料的制备 | 第129-130页 |
| 6.2.2.2 定向固定化Kringle 5蛋白与VDAC-1受体蛋白的相互作用 | 第130-131页 |
| 6.3 结果与分析 | 第131-142页 |
| 6.3.1 SPR研究Kringle 5蛋白与筛选蛋白的相互作用 | 第131-132页 |
| 6.3.2 SPR研究VDAC-1与Kringle 5的互作 | 第132-141页 |
| 6.3.2.1 Kringle 5蛋白在CM芯片表面偶联条件的优化 | 第132-137页 |
| 6.3.2.2 Kringle 5蛋白在CM5芯片表面的偶联 | 第137-138页 |
| 6.3.2.3 Kringle 5蛋白与VDAC-1蛋白的结合分析 | 第138-139页 |
| 6.3.2.4 Kringle 5蛋白与VDAC-1蛋白的热力学分析 | 第139-141页 |
| 6.3.2.5 CM5芯片的再生及再生次数的研究 | 第141页 |
| 6.3.3 前沿色谱研究VDAC-1与Kringle 5的相互作用 | 第141-142页 |
| 6.3.3.1 前言色谱法研究Kringle 5蛋白与VDAC-1蛋白的相互作用 | 第141-142页 |
| 6.4 讨论 | 第142-145页 |
| 结论 | 第145-147页 |
| 参考文献 | 第147-155页 |
| 附件 | 第155-158页 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 | 第158-159页 |
| 致谢 | 第159-160页 |
| 作者简介 | 第160页 |
