| 致谢 | 第1-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| 1 文献综述 | 第9-17页 |
| ·SRNA 对植物生长发育的作用 | 第9-11页 |
| ·sRNA 参与植物的生长发育 | 第9-10页 |
| ·sRNA 参与籽粒发育 | 第10-11页 |
| ·24 nt-siRNA 对基因表达的调控机制 | 第11-13页 |
| ·sRNA 介导的 DNA 甲基化 | 第11-12页 |
| ·siRNA 与 DNA 甲基化 | 第11-12页 |
| ·亚硫酸盐法检测 DNA 甲基化 | 第12页 |
| ·sRNA 切割靶基因调控基因表达 | 第12-13页 |
| ·24 nt-siRNA 合成路径及三种重要的酶 | 第13-15页 |
| ·24 nt-siRNA 合成路径 | 第13页 |
| ·24 nt-siRNA 合成路径中三中重要的酶 | 第13-15页 |
| ·RNA 干扰载体的构建方法 | 第15-17页 |
| ·酶切连接法和 Gateway 克隆技术 | 第15页 |
| ·简易 RNAi 载体构建法 | 第15-17页 |
| 2 引言 | 第17-18页 |
| 3 材料与方法 | 第18-28页 |
| ·材料 | 第18页 |
| ·植物材料、菌种及表达载体 | 第18页 |
| ·实验试剂及引物 | 第18页 |
| ·方法 | 第18-28页 |
| ·水稻籽粒 24 nt-siRNA 定量验证及靶基因甲基化检测 | 第18-20页 |
| ·强弱势粒 RNA 与 DNA 的提取 | 第18页 |
| ·强弱势粒 24 nt-siRNA 的 RT-PCR 验证 | 第18-19页 |
| ·亚硫酸盐测序法检测 DNA 甲基化状态 | 第19-20页 |
| ·CyMATE 在线软件分析 DNA 甲基化水平 | 第20页 |
| ·籽粒 24 nt-siRNA 靶基因的 5’RACE 切割验证 | 第20-21页 |
| ·根据小 RNA 测序结果筛选基因，设计引物 | 第20页 |
| ·24 nt-siRNA 靶基因 5’端扩增 | 第20-21页 |
| ·TA 克隆与菌落验证 | 第21页 |
| ·水稻籽粒胚乳特异性表达载体 pCAMBIA1301-Gt13a 的构建 | 第21-23页 |
| ·Gt13a 的扩增与 pMD18-T-Gt13a 的构建 | 第21-22页 |
| ·表达载体 pCAMBIA1301-Gt13a 的构建 | 第22-23页 |
| ·水稻籽粒胚乳特异性简易载体 RNAi 的构建 | 第23-25页 |
| ·水稻小干扰片段的设计与合成 | 第24页 |
| ·简易 RNAi 载体的构建 | 第24-25页 |
| ·农杆菌 EHA105 感受态细胞制备与所需培养基的配制 | 第25-26页 |
| ·农杆菌 EHA105 感受态细胞 | 第25页 |
| ·所需培养基的配制 | 第25-26页 |
| ·根癌农杆菌 EHA105 介导的水稻愈伤转基因过程 | 第26-27页 |
| ·质粒转化根癌农杆菌 EHA105 | 第26页 |
| ·携带质粒的根癌农杆菌介导的水稻愈伤转化 | 第26-27页 |
| ·RNAi 转基因水稻 GUS 化学活性检测及目的基因 RT-PCR 定量验证 | 第27-28页 |
| ·RNAi 转基因水稻叶片 GUS 化学活性检测 | 第27页 |
| ·RNAi 转基因水稻籽粒目的基因 RT-PCR 定量验证 | 第27-28页 |
| ·RNAi 转基因籽粒单粒重及籽粒大小的测定 | 第28页 |
| 4 结果与分析 | 第28-43页 |
| ·强弱势粒 24 nt-siRNA 表达量与靶基因甲基化差异 | 第28-32页 |
| ·亚硫酸盐处理后靶基因的扩增 | 第28-29页 |
| ·强弱势粒 24 nt-siRNA 在靶基因上的分布状态及 RT-PCR 验证 | 第29-30页 |
| ·CyMATE 在线软件分析 DNA 甲基化水平 | 第30-31页 |
| ·强弱势粒间靶基因甲基化差异分析 | 第31-32页 |
| ·水稻籽粒 24 nt-siRNA 对靶基因的切割 | 第32-35页 |
| ·PCR 扩增检测靶基因的表达 | 第32-33页 |
| ·24 nt-siRNA 的 5’端扩增及 TA 克隆检测 | 第33-34页 |
| ·靶基因 LOC_Os06g19990 切割位点的测序分析 | 第34页 |
| ·siRNA 在靶基因 LOC_Os06g19990 切割位点处的分布 | 第34-35页 |
| ·水稻籽粒胚乳特异性表达载体 pCAMBIA1301-Gt13a 的构建 | 第35-37页 |
| ·Gt13a 的扩增与 pMD 18-T-GT13a 的构建 | 第35-36页 |
| ·胚乳特异性表达载体 pCAMBIA1301-Gt13a 的构建 | 第36-37页 |
| ·水稻籽粒胚乳特异性简易载体 RNAI 的构建 | 第37-38页 |
| ·水稻小干扰片段的设计与合成 | 第37页 |
| ·目的基因小干扰片段及简易 RNAi 表达载体的 PCR 检测 | 第37-38页 |
| ·农杆菌 EHA105 介导的水稻转基因苗 | 第38-40页 |
| ·RNAi 转基因水稻 GUS 化学活性检测及目的基因 RT-PCR 定量验证 | 第40-41页 |
| ·RNAi 转基因水稻叶片 GUS 化学活性检测 | 第40页 |
| ·RNAi 转基因水稻籽粒目的基因 RT-PCR 定量验证 | 第40-41页 |
| ·RNAi 转基因籽粒表型鉴定 | 第41-43页 |
| ·转基因水稻与野生型日本晴籽粒粒长和粒宽 | 第41页 |
| ·RNAi 转基因籽粒单粒重及籽粒长与宽的测定 | 第41-43页 |
| 5 讨论与结论 | 第43-49页 |
| ·水稻简易 RNAi 表达载体的构建 | 第43-45页 |
| ·简易 RNAi 载体构建步骤的优点 | 第43-44页 |
| ·简易 RNAi 干扰片段的结构特点及对目的基因表达的沉默效果 | 第44-45页 |
| ·24 nt-siRNA 对基因的调控机制 | 第45-46页 |
| ·24 nt-siRNA 指导强弱势粒间 DNA 甲基化 | 第45页 |
| ·24 nt-siRNA 切割靶基因调控基因表达 | 第45-46页 |
| ·24 nt-siRNA 在籽粒灌浆充实中的作用 | 第46-47页 |
| ·存在问题与展望 | 第47-49页 |
| 参考文献 | 第49-54页 |
| 英文摘要 | 第54-56页 |
| 附录 1 实验所用引物 | 第56-57页 |
