| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 缩写词与符号 | 第9-11页 |
| 目录 | 第11-15页 |
| 第一部分 文献综述 | 第15-31页 |
| 1 细菌分泌系统简介 | 第15-16页 |
| 2 V型分泌系统 | 第16-23页 |
| ·Ⅴ型分泌蛋白的分类与转运机制 | 第17-22页 |
| ·Ⅴ型分泌蛋白的跨内膜转运 | 第18页 |
| ·经典自转运子模型 | 第18-19页 |
| ·双分子伴侣分泌系统 | 第19-20页 |
| ·三聚体自转运子 | 第20-21页 |
| ·双分子伴侣融合分泌系统 | 第21页 |
| ·反式自转运子模型 | 第21-22页 |
| ·Ⅴ型分泌系统的应用 | 第22-23页 |
| 3 Ⅵ型分泌系统研究进展 | 第23-27页 |
| ·Ⅵ型分泌系统结构组成与分泌机制 | 第23-25页 |
| ·Ⅵ型分泌系统蛋白分泌调控机制 | 第25-26页 |
| ·铜绿假单胞菌中的Ⅵ型分泌系统 | 第26-27页 |
| 4 分泌蛋白EstA、PlpD、Tse1、Tse3简介 | 第27-28页 |
| ·酯酶EstA | 第27页 |
| ·脂酶PlpD | 第27-28页 |
| ·溶菌酶Tse1与Tse3 | 第28页 |
| 5 研究内容、目的及意义 | 第28-31页 |
| ·研究内容及目的 | 第28-29页 |
| ·本实验的研究意义 | 第29-31页 |
| 第二部分 实验研究 | 第31-71页 |
| 1 实验仪器、材料与试剂 | 第31-37页 |
| ·主要仪器设备 | 第31-32页 |
| ·实验所用菌株、载体和引物 | 第32-33页 |
| ·主要试剂 | 第33页 |
| ·培养基配制 | 第33-34页 |
| ·主要溶液及其配制 | 第34-37页 |
| ·细菌总DNA抽提相关试剂 | 第34页 |
| ·质粒DNA抽提相关试剂 | 第34页 |
| ·DNA电泳相关试剂 | 第34-35页 |
| ·诱导表达相关试剂 | 第35页 |
| ·SDS-PAGE所用溶液及胶的配制 | 第35-36页 |
| ·考马斯亮蓝法测蛋白质浓度所需试剂 | 第36页 |
| ·可溶性蛋白纯化所需试剂 | 第36页 |
| ·包涵体纯化所需试剂 | 第36-37页 |
| ·Western blotting相关试剂 | 第37页 |
| ·胞外蛋白提取相关试剂 | 第37页 |
| ·透析袋的处理 | 第37页 |
| 2 试验方法 | 第37-52页 |
| ·细菌的培养 | 第37-38页 |
| ·plpD、estA、tse1、tse3基因的克隆与序列分析 | 第38-44页 |
| ·Pseudomonas aeruginosa ATCC27853基因组的抽提 | 第38页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第38-40页 |
| ·plpD、estA、tse1、tse3基因PCR扩增 | 第40-41页 |
| ·PCR产物回收检测,转化,阳性克隆子的筛选 | 第41-42页 |
| ·目的基因及测序结果的生物信息学分析 | 第42-43页 |
| ·表达载体的构建 | 第43-44页 |
| ·蛋白PlpD、EstA、Tse1、Tse3的表达 | 第44-45页 |
| ·TriS-甘氨酸SDS-PAGE电泳 | 第44-45页 |
| ·EstA、PlpD、Tse1、Tse3的大量表达 | 第45页 |
| ·可溶性蛋白的处理 | 第45页 |
| ·包涵体蛋白的处理 | 第45页 |
| ·蛋白PlpD、EstA、Tse1、Tse3的纯化 | 第45-47页 |
| ·装填螯合钴离子琼脂糖凝胶亲和层析柱 | 第46-47页 |
| ·螯合金属离子 | 第46页 |
| ·平衡柱子 | 第46页 |
| ·上样 | 第46页 |
| ·洗柱 | 第46-47页 |
| ·分步梯度洗脱 | 第47页 |
| ·蛋白PlpD、EstA、Tse1、Tse3的多克隆抗体制备 | 第47-49页 |
| ·PlpD、EstA、Tse1、Tse3蛋白作为抗原免疫新西兰大耳兔 | 第47页 |
| ·免疫血清的效价测定 | 第47-48页 |
| ·Bradford法测定蛋白浓度 | 第48-49页 |
| ·细菌胞质蛋白的提取 | 第49页 |
| ·细菌间质蛋白的提取 | 第49页 |
| ·细菌胞外蛋白的提取 | 第49页 |
| ·Western blotting检测 | 第49-50页 |
| ·蛋白酶活比较 | 第50-52页 |
| ·Plp D、EstA蛋白酶活比较 | 第50-51页 |
| ·Tse 1、Tse 3蛋白酶活比较方法 | 第51-52页 |
| 3. 实验结果 | 第52-71页 |
| ·P.aeruginosa ATCC27853基因组的抽提 | 第52页 |
| ·estA、plpD、tse1、tse3、基因PCR扩增 | 第52-60页 |
| ·目的基因的克隆与琼脂糖凝胶检测 | 第52-53页 |
| ·PCR扩增产物的生物信息学分析 | 第53-60页 |
| ·PlpD、EstA、Tse1和Tse3的表达 | 第60-63页 |
| ·estA、plpD、tse1、tse3基因的表达 | 第61-62页 |
| ·可溶性蛋白Tse 1蛋白的纯化 | 第62页 |
| ·包涵体蛋白EstA、PlpD、Tse 3蛋白的纯化 | 第62-63页 |
| ·PlpD、EstA、Tsel、Tse 3多克隆抗体的制备与效价的测定 | 第63-65页 |
| ·Western blotting检测蛋白分泌量的差异 | 第65-68页 |
| ·PlpD蛋白Western blotting检测 | 第65-66页 |
| ·EstA蛋白Western blotting检测 | 第66-67页 |
| ·Tse1和Tse3蛋白Western blotting检测 | 第67-68页 |
| ·脂肪酶酶活测定 | 第68-69页 |
| ·溶菌酶Tse1、Tse3酶活的比较 | 第69-71页 |
| ·P.aerugionsaATCC27853和P.aerugionsa ATCC27853 pcs-Amp抗性筛选 | 第69页 |
| ·抑菌试验 | 第69-71页 |
| 第三部分 讨论与展望 | 第71-74页 |
| 参考文献 | 第74-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
