| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-9页 |
| 主要符号对照表 | 第9-11页 |
| 第1章 引言 | 第11-25页 |
| ·聚羟基脂肪酸酯（PHA）概述 | 第11-14页 |
| ·PHA 的结构和分类 | 第11-12页 |
| ·PHA 的性能和应用 | 第12-14页 |
| ·PHA 生物合成途径和关键酶 | 第14-18页 |
| ·由乙酰辅酶 A 合成 PHB | 第15-16页 |
| ·由脂肪酸β-氧化途径合成 PHA | 第16页 |
| ·由脂肪酸从头合成途径合成 PHA | 第16-17页 |
| ·PHA 聚合酶（PhaC） | 第17-18页 |
| ·短链中长链共聚 PHA 的合成 | 第18-19页 |
| ·大肠杆菌中基因表达的优化方法 | 第19-21页 |
| ·转录水平的优化 | 第20页 |
| ·翻译水平的优化 | 第20-21页 |
| ·其他优化方法 | 第21页 |
| ·常用 DNA 重组系统 | 第21-23页 |
| ·同源重组 | 第21-22页 |
| ·attBP 重组系统 | 第22页 |
| ·Cre-loxP 重组系统 | 第22页 |
| ·FLP-FRT 重组系统 | 第22-23页 |
| ·外源基因基于大肠杆菌染色体的表达 | 第23页 |
| ·本论文研究的目的和意义 | 第23-25页 |
| 第2章 实验材料与方法 | 第25-39页 |
| ·实验材料 | 第25-29页 |
| ·菌种 | 第25页 |
| ·质粒 | 第25-28页 |
| ·常用分子生物学试剂 | 第28页 |
| ·常用生物化学试剂 | 第28页 |
| ·DNA 分子量标准 | 第28-29页 |
| ·实验仪器和设备 | 第29-30页 |
| ·实验方法 | 第30-39页 |
| ·分子生物学常规操作 | 第30-31页 |
| ·重叠延伸聚合酶链式反应（OE-PCR） | 第31页 |
| ·基于同源重组的基因敲除 | 第31-33页 |
| ·基于 att 位点的点特异性重组 | 第33-34页 |
| ·抗生素的配制 | 第34页 |
| ·常用缓冲液和培养基配制 | 第34-35页 |
| ·摇瓶培养和细胞干重测定 | 第35-36页 |
| ·PHA 样品分析 | 第36-37页 |
| ·细菌总蛋白提取和蛋白分析 | 第37页 |
| ·荧光显微观测和定量 | 第37页 |
| ·荧光定量 PCR 测定基因拷贝数和 mRNA 丰度 | 第37-39页 |
| 第3章 大肠杆菌中 PHA 聚合酶基因 phaC2Ps的优化表达 | 第39-54页 |
| ·本章导读 | 第39-40页 |
| ·双点突变型 PhaC2PsQKST 的优化方案 | 第40-45页 |
| ·双点突变型 PhaC2PsQKST 的原始密码子分析和密码子优化 | 第40-42页 |
| ·在优化后读码框的 5’端插入茎环结构 | 第42页 |
| ·不同聚合酶 PhaC2Ps的克隆和质粒构建 | 第42-45页 |
| ·优化方法影响 PHA 聚合酶基因的异源表达 | 第45-48页 |
| ·构建用于评价基因表达水平的系列质粒 | 第45-46页 |
| ·茎环结构对于 mRNA 稳定性的影响 | 第46-47页 |
| ·密码子优化和茎环结构对于蛋白表达量的影响 | 第47-48页 |
| ·优化方法影响 PHA 的合成 | 第48-53页 |
| ·优化方法对于 PHB 合成的影响 | 第48-49页 |
| ·优化方法对于短链中长链共聚 PHA 合成的影响 | 第49-51页 |
| ·不同比例碳源对短链中长链共聚 PHA 合成的影响 | 第51-53页 |
| ·小结 | 第53-54页 |
| 第4章 基于染色体表达 PHA 合成基因的位点和拷贝数效应 | 第54-82页 |
| ·本章导读 | 第54-55页 |
| ·带有外源基因的重组质粒构建 | 第55-61页 |
| ·构建带有不同启动子和 PHA 合成基因的自杀质粒 | 第55-58页 |
| ·不同启动子对自杀质粒合成 PHA 能力的影响 | 第58页 |
| ·构建带有 gltA 启动子和不同靶基因的 attBP 重组质粒 | 第58-60页 |
| ·多基因循环重组系统中重组质粒的构建 | 第60-61页 |
| ·整合位点对外源基因表达量的影响 | 第61-70页 |
| ·构建敲除用自杀质粒和大肠杆菌φ80attB 缺陷株 | 第62-64页 |
| ·在不同位点插入外源基因 | 第64-68页 |
| ·测定位点对外源基因转录和表达水平的影响 | 第68-70页 |
| ·拷贝数对基因表达的影响 | 第70-80页 |
| ·利用多基因循环重组系统进行单位点多拷贝整合 | 第71-75页 |
| ·利用 Dual-In Out 重组系统进行多位点多拷贝整合 | 第75页 |
| ·重组菌中靶基因拷贝数的测定 | 第75-77页 |
| ·拷贝数对靶基因表达的影响 | 第77-80页 |
| ·小结 | 第80-82页 |
| 第5章 大肠杆菌中单位点多拷贝整合 PHA 合成基因 | 第82-94页 |
| ·本章导读 | 第82-83页 |
| ·构建合适的宿主菌和重组质粒 | 第83-85页 |
| ·质粒构建 | 第84页 |
| ·向染色体中插入 loxP 位点 | 第84-85页 |
| ·向大肠杆菌中多拷贝整合 phbCAB | 第85-89页 |
| ·构建用于整合的自杀质粒 | 第86-87页 |
| ·自杀质粒的染色体整合和多拷贝诱导 | 第87-89页 |
| ·多拷贝整合菌株的 PHA 合成和拷贝数分析 | 第89-92页 |
| ·检测多拷贝整合菌株的 PHA 合成能力 | 第89-90页 |
| ·多拷贝整合菌株的拷贝数分析 | 第90-91页 |
| ·多拷贝整合菌株的稳定性分析 | 第91-92页 |
| ·小结 | 第92-94页 |
| 第6章 总结 | 第94-102页 |
| ·讨论与展望 | 第94-100页 |
| ·本节导读 | 第94-95页 |
| ·PHA 合成基因的系统性优化 | 第95-96页 |
| ·PHA 合成基因的染色体表达 | 第96-97页 |
| ·与碳源利用相关的代谢通路改造 | 第97页 |
| ·调节 PHA 通路中 C 的流向和流量 | 第97-98页 |
| ·简化子构建 PHA 生产菌底盘 | 第98-100页 |
| ·结论 | 第100-102页 |
| 参考文献 | 第102-113页 |
| 致谢 | 第113-115页 |
| 附录 A 人工合成 DNA 序列 | 第115-120页 |
| 附表1 向13个染色体位点插入外源基因用扩增和验证引物 | 第120-125页 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第125页 |
