| 摘要 | 第1-4页 |
| 英文摘要 | 第4-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-27页 |
| 1．1 乙醛酸概述 | 第11页 |
| 1．2 乙醛酸的主要用途 | 第11-13页 |
| 1．2．1 制取香料 | 第11-12页 |
| 1．2．1．1 制取香兰素 | 第11页 |
| 1．2．1．2 制取乙基香兰素 | 第11-12页 |
| 1．2．2 制取尿囊素 | 第12页 |
| 1．2．3 制取医药中间体 | 第12页 |
| 1．2．3．1 制取对羟基苯甘氨酸 | 第12页 |
| 1．2．3．2 制取对羟基苯乙酸 | 第12页 |
| 1．2．3．3 制取苯乙酮 | 第12页 |
| 1．2．4 生产农药中间体 | 第12-13页 |
| 1．2．5 生产水处理剂羟基膦羧酸 | 第13页 |
| 1．2．6 合成其它芳香醛类 | 第13页 |
| 1．3 乙醛酸的合成方法 | 第13-17页 |
| 1．3．1 化学合成法 | 第13-15页 |
| 1．3．1．1 氧化法 | 第13页 |
| 1．3．1．2 还原法 | 第13-15页 |
| 1．3．1．3 水解法 | 第15页 |
| 1．3．2 生物合成法 | 第15-17页 |
| 1．3．2．1 直接转化生产乙醛酸 | 第16页 |
| 1．3．2．2 固定化酶法生产乙醛酸 | 第16-17页 |
| 1．4 乙醇酸氧化酶的研究 | 第17-20页 |
| 1．4．1 乙醇酸氧化酶的来源 | 第17页 |
| 1．4．2 乙醇酸氧化酶的结构和特征 | 第17-18页 |
| 1．4．3 乙醇酸氧化酶作用机理 | 第18页 |
| 1．4．4 乙醇酸氧化酶活性测定 | 第18页 |
| 1．4．5 国内外菠菜乙醇酸氧化酶基因表达研究进展 | 第18-20页 |
| 1．4．5．1 菠菜乙醇酸氧化酶基因在E．coli中的表达 | 第18-19页 |
| 1．4．5．2 菠菜乙醇酸氧化酶基因在酿酒酵母中的表达 | 第19页 |
| 1．4．5．3 菠菜乙醇酸氧化酶基因在Pichiapastoris中表达 | 第19-20页 |
| 1．5 毕赤氏酵母表达体系 | 第20-25页 |
| 1．5．1 Pichia pastoris生物学活性 | 第21页 |
| 1．5．2 毕赤氏酵母细胞学研究 | 第21页 |
| 1．5．3 毕赤氏酵母的分子生物学 | 第21-23页 |
| 1．5．3．1 宿主菌的分子生物学 | 第21-22页 |
| 1．5．3．2 表达载体类型及用途 | 第22-23页 |
| 1．5．4 毕赤氏酵母表达策略 | 第23-25页 |
| 1．5．4．1 表达盒的自主复制与染色体上的融合 | 第23页 |
| 1．5．4．2 表达盒的整合位点 | 第23页 |
| 1．5．4．3 宿主利用甲醇的表型 | 第23页 |
| 1．5．4．4 基因剂量 | 第23-24页 |
| 1．5．4．5 mRNA5ˊ非翻译区 | 第24页 |
| 1．5．4．6 翻译起始密码AUG的背景 | 第24页 |
| 1．5．4．7 A+T元素 | 第24页 |
| 1．5．4．8 分泌信号 | 第24-25页 |
| 1．5．4．9 产物稳定性 | 第25页 |
| 1．5．5 毕赤氏酵母发酵策略 | 第25页 |
| 1．6 本文研究的目的意义及主要内容 | 第25-27页 |
| 第二章 乙醇酸氧化酶酵母表达载体的构建与鉴定 | 第27-42页 |
| 2．1 引言 | 第27页 |
| 2．2 实验试剂与仪器 | 第27-28页 |
| 2．2．1 实验试剂 | 第27-28页 |
| 2．2．2 实验仪器 | 第28页 |
| 2．3 材料和方法 | 第28-36页 |
| 2．3．1 实验材料 | 第28-29页 |
| 2．3．1．1 菌种来源 | 第28页 |
| 2．3．1．2 培养基 | 第28-29页 |
| 2．3．1．3 引物的设计与合成 | 第29页 |
| 2．3．2 实验方法 | 第29-36页 |
| 2．3．2．1 质粒DNA提取 | 第29-31页 |
| 2．3．2．2 DNA纯度检测 | 第31页 |
| 2．3．2．3 克隆载体pMD-T-GO和表达载体pPIC3．5K酶切反应 | 第31-32页 |
| 2．3．2．4 酶切产物的纯化 | 第32页 |
| 2．3．2．5 目的片段和酶切载体的连接 | 第32-33页 |
| 2．3．2．6 转化 | 第33-34页 |
| 2．3．2．7 重组质粒的鉴定 | 第34-36页 |
| 2．3．2．8 阳性克隆的保存 | 第36页 |
| 2．4 结果与讨论 | 第36-41页 |
| 2．4．1 重组质粒构建示意图 | 第36页 |
| 2．4．2 质粒大量提取 | 第36-37页 |
| 2．4．3 DNA纯度检测 | 第37页 |
| 2．4．4 pMD-T-GO和pPIC3．5K的酶切 | 第37-38页 |
| 2．4．5 目的片段和目的载体的回收 | 第38页 |
| 2．4．6 目的片段和表达载体的连接 | 第38-39页 |
| 2．4．7 连接液的转化 | 第39页 |
| 2．4．8 重组子的初步鉴定 | 第39页 |
| 2．4．9 重组子PCR鉴定 | 第39-40页 |
| 2．4．10 重组子酶切鉴定 | 第40页 |
| 2．4．11 序列测定 | 第40-41页 |
| 2．5 小结 | 第41-42页 |
| 第三章 含乙醇酸氧化酶重组毕赤氏酵母菌的构建与表达 | 第42-58页 |
| 3．1 引言 | 第42-43页 |
| 3．2 实验仪器和试剂 | 第43-44页 |
| 3．2．1 实验仪器 | 第43-44页 |
| 3．2．2 实验试剂 | 第44页 |
| 3．3 材料和方法 | 第44-50页 |
| 3．3．1 实验材料 | 第44-45页 |
| 3．3．1．1 菌种来源 | 第44页 |
| 3．3．1．2 培养基 | 第44-45页 |
| 3．3．2 实验方法 | 第45-50页 |
| 3．3．2．1 质粒大量提取 | 第45页 |
| 3．3．2．2 重组质粒pPIC3．5K-GO线形化 | 第45页 |
| 3．3．2．3 酶切质粒的纯化浓缩 | 第45-46页 |
| 3．3．2．4 酵母的电转化 | 第46页 |
| 3．3．2．5 G418抗性的筛选 | 第46页 |
| 3．3．2．6 酵母染色体基因组DNA的提取 | 第46-47页 |
| 3．3．2．7 PCR鉴定整合情况 | 第47页 |
| 3．3．2．8 菌种保存 | 第47页 |
| 3．3．2．9 乙醇酸氧化酶的诱导表达 | 第47-48页 |
| 3．3．2．10 SDS-PAGE电泳 | 第48-49页 |
| 3．3．2．11 乙醇酸氧化酶酶活测定原理 | 第49页 |
| 3．3．2．12 DCIP标准曲线 | 第49-50页 |
| 3．3．2．13 乙醇酸氧化酶酶活测定 | 第50页 |
| 3．3．2．14 表达条件的优化 | 第50页 |
| 3．4 结果与讨论 | 第50-57页 |
| 3．4．1 重组质粒pPIC3．5K-GO的线形化 | 第50-51页 |
| 3．4．2 电转化 | 第51页 |
| 3．4．3 G418抗性筛选 | 第51页 |
| 3．4．4 酵母基因组的提取 | 第51-52页 |
| 3．4．5 重组菌落PCR鉴定 | 第52页 |
| 3．4．6 甲醇诱导表达 | 第52-54页 |
| 3．4．7 表达条件的优化 | 第54-57页 |
| 3．4．7．1 时间对表达的影响 | 第54页 |
| 3．4．7．2 甲醇对表达的影响 | 第54-55页 |
| 3．4．7．3 温度对表达的影响 | 第55-56页 |
| 3．4．7．4 培养基pH对表达的影响 | 第56页 |
| 3．4．7．5 菌密度对表达的影响 | 第56-57页 |
| 3．5 小结 | 第57-58页 |
| 第四章 结论与展望 | 第58-60页 |
| 4．1 结论 | 第58-59页 |
| 4．2 展望 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 附录 1 | 第65-66页 |
| 附录 2 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
