| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-16页 |
| 第一章 前言 | 第16-19页 |
| 第一部分 HPV16E6转染对宫颈癌C33A细胞生物学功能的影响 | 第19-41页 |
| 第一章 材料与方法 | 第19-34页 |
| 1 材料 | 第19-24页 |
| ·细胞株 | 第19页 |
| ·真核表达质粒载体 | 第19页 |
| ·试剂 | 第19-21页 |
| ·酶类 | 第19页 |
| ·试剂盒 | 第19-20页 |
| ·细胞培养与转染用试剂 | 第20页 |
| ·抗体 | 第20页 |
| ·PCR引物和Marker | 第20页 |
| ·其它生化试剂 | 第20-21页 |
| ·主要仪器 | 第21页 |
| ·主要试剂的配制 | 第21-24页 |
| 2 方法 | 第24-34页 |
| ·细胞培养:细胞的传代、冻存与复苏 | 第24-25页 |
| ·pcDNA3/HPV16E6、pcDNA3稳定转染(脂质体法)宫颈癌C33A细胞 | 第25页 |
| ·细胞总RNA的抽提、纯化和检测 | 第25-27页 |
| ·抽提RNA过程中相关试剂与器皿的处理 | 第26页 |
| ·培养细胞总RNA的抽提 | 第26页 |
| ·细胞总RNA琼脂糖凝胶电泳 | 第26-27页 |
| ·差异RT-PCR检测转染细胞中HPV16E6mRNA水平 | 第27-29页 |
| ·消化RNA中的痕量基因组DNA | 第27-28页 |
| ·逆转录(RNA→cDNA) | 第28页 |
| ·聚合酶链式反应PCR | 第28-29页 |
| ·PCR产物电泳(步骤同琼脂糖凝胶电泳) | 第29页 |
| ·反应条件的确定 | 第29页 |
| ·半定量分析 | 第29页 |
| ·Western blotting检测转染细胞中HPV16E6蛋白表达水平 | 第29-31页 |
| ·制备用于Western blotting的蛋白质 | 第29-30页 |
| ·Western Blotting检测HPV16E6蛋白的表达 | 第30-31页 |
| ·HPV16E6基因转染对C33A细胞生物学功能的影响 | 第31-33页 |
| ·转染细胞生长曲线的绘制 | 第31-32页 |
| ·MTT比色法检测HPV16E6转染对C33A细胞生长增殖的影响 | 第32页 |
| ·流式细胞仪检测HPV16E6对C33A细胞周期的影响 | 第32-33页 |
| ·统计学分析 | 第33-34页 |
| 第二章 结果 | 第34-41页 |
| ·HPV16E6基因重组体的脂质体转染和克隆筛选鉴定 | 第34-36页 |
| ·细胞总RNA的抽提 | 第34-35页 |
| ·消化RNA中痕量基因组DNA后的RNA质量验证 | 第35页 |
| ·RT-PCR检测细胞HPV16E6mRNA表达水平 | 第35页 |
| ·Western blotting检测转染细胞HPV16E6和p53~(?)蛋白的表达 | 第35-36页 |
| ·HPV16E6基因转染对C33A细胞生物学功能的影响 | 第36-41页 |
| ·转染细胞生长曲线的绘制 | 第36-37页 |
| ·HPV16E6转染对C33A细胞生长增殖的影响 | 第37-38页 |
| ·HPV16E6基因转染对C33A细胞周期的影响 | 第38-41页 |
| 第二部分 HPV16E6对不同p53基因型宫颈癌细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响及可能的机制 | 第41-112页 |
| 第二章 材料与方法 | 第41-51页 |
| ·材料 | 第41-43页 |
| ·细胞 | 第41页 |
| ·试剂 | 第41-42页 |
| ·化疗药物 | 第42页 |
| ·PCR引物和Marker | 第42页 |
| ·主要仪器 | 第42-43页 |
| ·主要试剂的配制 | 第43页 |
| ·方法 | 第43-50页 |
| ·细胞培养:细胞的传代、冻存与复苏 | 第43页 |
| ·MTT比色法检测化疗药物对宫颈癌细胞增殖或生长抑制的影响 | 第43-44页 |
| ·凋亡试验:吖啶橙(AO)/溴化乙啶(EB)双染法检测各组细胞经化疗药物干预后的凋亡情况 | 第44页 |
| ·Annexine V-FITC/PI双色荧光流式细胞仪检测各化疗药物对C33A-E6、C33A、C33A-P、CaSki细胞凋亡的影响 | 第44-45页 |
| ·制备用于Western blotting的蛋白质 | 第45-46页 |
| ·Western Blotting检测化疗药物作用后HPV16E6和p53蛋白水平变化 | 第46-47页 |
| ·抽提RNA过程中相关试剂与器皿的处理 | 第47页 |
| ·培养细胞RNA的抽提 | 第47-48页 |
| ·差异RT-PCR | 第48-50页 |
| ·统计学分析 | 第50-51页 |
| 第三章 结果 | 第51-79页 |
| ·E6基因和不同化疗药物干预对不同p53表型的宫颈癌细胞生长增殖的影响 | 第51-60页 |
| ·化疗药物干预对各株细胞凋亡的影响 | 第60-71页 |
| ·AO/EB染色结合荧光显微镜技术鉴定细胞凋亡情况 | 第60-66页 |
| ·流式细胞仪检测细胞凋亡率 | 第66-71页 |
| ·Western blotting检测不同浓度DDP对HPV16E6和p53~(?)蛋白表达的影响 | 第71-75页 |
| ·各组细胞蛋白浓度测定标准曲线的建立 | 第71页 |
| ·各组细胞总蛋白浓度测定结果 | 第71-72页 |
| ·Western blotting检测不同浓度DDP对各株细胞HPV16E6和p53~(?)蛋白表达的影响 | 第72-75页 |
| ·RT-PCR检测不同浓度DDP对各株细胞HPV16E6基因mRNA表达水平的影响 | 第75-79页 |
| ·细胞总RNA抽提的质量 | 第75页 |
| ·消化RNA中痕量基因组DNA后的RNA质量验证 | 第75-76页 |
| ·RT-PCR检测不同浓度DDP对各株细胞中HPV16E6mRNA表达水平的影响 | 第76-79页 |
| 第四章 讨论 | 第79-88页 |
| ·HPVE6与p53的结构和功能 | 第79-80页 |
| ·HPV16E6基因在不同p53活性状态下对宫颈癌细胞生长增殖和凋亡的影响 | 第80-82页 |
| ·化疗药物对宫颈癌细胞HPV16E6和p53~(?)表达的影响 | 第82-83页 |
| ·HPV16E6影响宫颈癌细胞增殖与凋亡的途径及机制探讨 | 第83-85页 |
| ·HPV16E6在不同p53活性状态下对宫颈癌细胞化疗敏感性的影响 | 第85-88页 |
| 第五章 结论 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-94页 |
| 第六章 综述 | 第94-112页 |
| 致谢 | 第112-114页 |
| 攻读学位期间主要的研究成果目录 | 第114-116页 |
