| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-6页 |
| 中文文摘 | 第6-12页 |
| 第1章 绪论 | 第12-32页 |
| ·课题背景 | 第12-13页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第13-22页 |
| ·毕赤酵母表达载体 | 第15-18页 |
| ·启动子 | 第16-17页 |
| ·信号序列 | 第17-18页 |
| ·选择标记 | 第18页 |
| ·整合方法 | 第18页 |
| ·影响外源基因在毕赤酵母中表达的因素 | 第18-22页 |
| ·目的基因的特性 | 第19-20页 |
| ·基因剂量 | 第20页 |
| ·信号肽序列 | 第20-21页 |
| ·宿主、整合方式及转化子表型 | 第21页 |
| ·培养条件 | 第21-22页 |
| ·脂肪酶基因的异源表达 | 第22-23页 |
| ·脂肪酶的分子改造 | 第23-32页 |
| ·理性设计(Rational design) | 第24-25页 |
| ·定向进化技术(Directed evolution strategies) | 第25-31页 |
| ·定向进化的方法 | 第25-30页 |
| ·定向进化的筛选策略 | 第30-31页 |
| ·定点突变与定向进化相结合 | 第31-32页 |
| 第2章 材料与方法 | 第32-50页 |
| ·材料 | 第32-34页 |
| ·菌种和载体 | 第32页 |
| ·工具酶 | 第32页 |
| ·其它试剂 | 第32页 |
| ·常用培养基和缓冲液 | 第32-33页 |
| ·寡聚核苷酸引物 | 第33-34页 |
| ·常用仪器 | 第34页 |
| ·实验方法 | 第34-50页 |
| ·表达载体(pGAPZA-lip07)的构建及其在P_(GAP)下的表达 | 第34-42页 |
| ·目的基因的获得 | 第34-35页 |
| ·克隆载体pSK-lip07的构建 | 第35-36页 |
| ·重组质粒pSK-lip07的制备 | 第36-37页 |
| ·重组表达载体pGAPZA-lip07的构建与制备 | 第37-38页 |
| ·扩展青霉脂肪酶基因在P_(GAP)下的表达 | 第38-39页 |
| ·GS-pGAPZA-lip07发酵条件的优化 | 第39-40页 |
| ·表达产物PEL的鉴定 | 第40-41页 |
| ·发酵上清脂肪酶酶活的测定 | 第41-42页 |
| ·定点突变 | 第42-50页 |
| ·扩展青霉脂肪酶K202A的叠加突变 | 第42-44页 |
| ·扩展青霉脂肪酶N73T的叠加突变 | 第44-46页 |
| ·扩展青霉脂肪酶K202A、K202E、S153P、Q176P、S91K、H107R、N157Y的单点突变 | 第46-50页 |
| 第3章 结果与分析 | 第50-72页 |
| ·扩展青霉脂肪酶基因在P_(GAP)启动下的表达 | 第50-57页 |
| ·表达载体pGAPZA-lip07的构建及鉴定 | 第50页 |
| ·重组酵母菌GS-pGAPZA-lip07的筛选 | 第50-51页 |
| ·GS-pGAPZA-lip07发酵条件的优化 | 第51-57页 |
| ·不同碳源对GS-pGAPZA-lip07表达的影响 | 第51-54页 |
| ·不同甘油浓度对GS-pGAPZA-lip07表达的影响 | 第54页 |
| ·不同起始细胞密度对GS-pGAPZA-lip07表达的影响 | 第54-55页 |
| ·不同起始pH对GS-pGAPZA-lip07表达的影响 | 第55-57页 |
| ·定点突变 | 第57-72页 |
| ·突变点的选择 | 第57-58页 |
| ·K202A的单点突变及叠加突变 | 第58-63页 |
| ·突变基因的获得 | 第58-60页 |
| ·突变基因在毕赤酵母GS115中的表达 | 第60-61页 |
| ·K202A突变体的最适作用温度和热稳定性研究 | 第61-63页 |
| ·N73T叠加突变 | 第63-66页 |
| ·突变基因的获得 | 第63-64页 |
| ·突变基因在毕赤酵母GS115中的表达 | 第64-65页 |
| ·N73T突变体的最适作用温度和热稳定性研究 | 第65-66页 |
| ·S153P、Q176P单点突变 | 第66-69页 |
| ·突变基因的获得 | 第66-67页 |
| ·突变基因在毕赤酵母GS115中的表达 | 第67-68页 |
| ·S153P、Q176P突变体的最适作用温度和热稳定性研究 | 第68-69页 |
| ·N157Y、K202E、S91K、H107R单点突变 | 第69-72页 |
| ·突变基因的获得 | 第69页 |
| ·突变基因在毕赤酵母GS115中的表达 | 第69-72页 |
| 第4章 讨论 | 第72-75页 |
| ·扩展青霉脂肪酶在P_(GAP)下的表达 | 第72-73页 |
| ·扩展青霉脂肪酶的定点突变 | 第73-75页 |
| 结论 | 第75-78页 |
| 附录 英文缩略词表 | 第78-80页 |
| 参考文献 | 第80-88页 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 | 第88-90页 |
| 致谢 | 第90-92页 |
| 个人简历 | 第92-93页 |
