| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-44页 |
| 1.核盘菌重寄生真菌盾壳霉的研究进展 | 第18-27页 |
| ·核盘菌及作物菌核病 | 第18-20页 |
| ·盾壳霉的分类及分布和多样性 | 第20-21页 |
| ·盾壳霉的生物学特性 | 第21页 |
| ·盾壳霉与寄主的互作 | 第21-22页 |
| ·盾壳霉的寄生生态学特性 | 第22-23页 |
| ·盾壳霉控制作物菌核病应用及规模化生产 | 第23-26页 |
| ·盾壳霉在作物菌核病防治中的应用 | 第23-25页 |
| ·盾壳霉的规模化生产 | 第25-26页 |
| ·盾壳霉的分子生物学研究 | 第26-27页 |
| 2 真菌孢子形成机理的研究 | 第27-31页 |
| ·孢子形成与作物真菌病害 | 第27页 |
| ·孢子形成与生防真菌的应用 | 第27-28页 |
| ·环境对真菌孢子形成的影响 | 第28-29页 |
| ·孢子形成的分子机理 | 第29-31页 |
| 3.真菌遗传转化研究进展 | 第31-37页 |
| ·真菌遗传转化研究手段及特点 | 第31-33页 |
| ·PEG介导的遗传转化 | 第31-32页 |
| ·限制性内切酶介导的遗传转化 | 第32页 |
| ·农杆菌介导的遗传转化 | 第32-33页 |
| ·农杆菌介导转化的基本原理及其应用 | 第33-37页 |
| ·农杆菌转化系统的发展 | 第33-34页 |
| ·农杆菌介导转化的基本原理 | 第34-35页 |
| ·农杆菌介导转化法(ATMT)在真菌转化中的应用 | 第35-37页 |
| 4 基因功能分析的策略 | 第37-40页 |
| ·基因敲除策略在基因功能研究中的应用 | 第38页 |
| ·RNAi技术在基因功能研究中的应用 | 第38-40页 |
| 5 本研究的立题依据和目的与意义 | 第40-44页 |
| 第二章 农杆菌介导高效转化盾壳霉及克隆相关基因技术平台的建立 | 第44-66页 |
| 1 材料 | 第45-46页 |
| ·菌株及载体 | 第45-46页 |
| ·抗生素 | 第46页 |
| ·酶、试剂盒及其它试剂 | 第46页 |
| ·其它试剂和培养基配制见附录1 | 第46页 |
| ·DNA分子量标记 | 第46页 |
| 2 方法 | 第46-56页 |
| ·农杆菌介导转化体系的优化 | 第46-47页 |
| ·农杆菌介导的转化 | 第46-47页 |
| ·用于转化的盾壳霉孢子最佳成熟度的筛选 | 第47页 |
| ·用于转化的盾壳霉最佳孢子浓度的筛选 | 第47页 |
| ·农杆菌菌液与盾壳霉孢子共培养时间对转化效率的影响 | 第47页 |
| ·TAIL-PCR技术与相关基因的克隆 | 第47-49页 |
| ·结合Southern杂交技术克隆相关基因 | 第49-52页 |
| ·Southern杂交分析 | 第49-51页 |
| ·反向PCR(Inverse-PCR)技术的应用 | 第51-52页 |
| ·cDNA文库的建立与相关基因的克隆 | 第52-56页 |
| ·盾壳霉ZS-1的培养 | 第52页 |
| ·RNA的提取和纯化 | 第52页 |
| ·cDNA文库的构建及文库质量的检测 | 第52页 |
| ·文库cDNA第一链合成 | 第52页 |
| ·文库cDNA第二链的合成及电泳检测 | 第52页 |
| ·蛋白酶K的降解 | 第52-53页 |
| ·Sfil酶的消化 | 第53页 |
| ·合适cDNA片段的收集和电泳检测 | 第53页 |
| ·cDNA的连接和噬菌体蛋白包装 | 第53-54页 |
| ·滴度未扩增文库 | 第54页 |
| ·大肠杆菌XL1-Blue株系的活化 | 第54页 |
| ·未扩增文库的滴度检测 | 第54页 |
| ·文库扩增 | 第54-55页 |
| ·文库质量的检测 | 第55-56页 |
| ·文库重组克隆百分比 | 第55页 |
| ·扩增文库滴度检测 | 第55-56页 |
| ·cDNA文库的应用 | 第56页 |
| 3 结果与分析 | 第56-64页 |
| ·农杆菌介导转化体系的优化 | 第56-59页 |
| ·用于转化的盾壳霉孢子最佳成熟度的筛选 | 第56-57页 |
| ·用于转化的盾壳霉最佳孢子浓度的筛选 | 第57-58页 |
| ·农杆菌菌液与盾壳霉孢子共培养时间对转化效率的影响 | 第58-59页 |
| ·TAIL—PCR技术与相关基因的克隆 | 第59-60页 |
| ·结合Southern杂交技术克隆相关基因 | 第60-62页 |
| ·cDNA文库的建立与相关基因的克隆 | 第62-64页 |
| ·盾壳霉ZS-1菌株总RNA的提取 | 第62-63页 |
| ·文库质量的检测 | 第63页 |
| ·cDNA文库的应用 | 第63-64页 |
| 4.结论与讨论 | 第64-66页 |
| 第三章 盾壳霉T-DNA插入体库的建立及部分产孢相关突变体的筛选及初步研究 | 第66-80页 |
| 1 材料与方法 | 第67-70页 |
| ·材料 | 第67-68页 |
| ·菌株 | 第67页 |
| ·培养基的配置 | 第67-68页 |
| ·酶、载体、试剂盒及其它试剂 | 第68页 |
| ·方法 | 第68-70页 |
| ·T-DNA标记插入体库的构建 | 第68页 |
| ·产孢缺陷型突变体的筛选 | 第68页 |
| ·产孢缺陷型突变体生长速度测定 | 第68页 |
| ·产孢缺陷型突变体寄生菌核致腐能力的比较 | 第68-69页 |
| ·产孢缺陷型突变体产抗生物质(抗真菌物质和抗细菌物质)的测定 | 第69页 |
| ·产孢缺陷型突变体T-DNA的插入拷贝数的分析 | 第69页 |
| ·TAIL-PCR扩增产孢缺陷型突变体代表性菌株T-DNA侧端基因组DNA | 第69-70页 |
| 2.结果与分析 | 第70-78页 |
| ·产孢缺陷型突变体的筛选及分类 | 第70-73页 |
| ·部分产孢缺陷型突变体的生长速度的测定结果 | 第73页 |
| ·产孢缺陷型突变体寄生致腐菌核能力的比较 | 第73-74页 |
| ·产孢缺陷型突变体产生抗生素的测定结果 | 第74-76页 |
| ·部分产孢缺陷型突变体T-DNA的插入拷贝数的分析 | 第76-77页 |
| ·部分产孢缺陷型突变体的TAIL—PCR扩增T-DNA标记两端基因组DNA序列及分析结果 | 第77-78页 |
| 3.结论与讨论 | 第78-80页 |
| 第四章:精氨酸通过一氧化氮调控盾壳霉分生孢子形成途径研究 | 第80-116页 |
| 1 材料与方法 | 第81-89页 |
| ·材料 | 第81-83页 |
| ·菌株及培养基 | 第81-82页 |
| ·酶、试剂盒及其它试剂 | 第82页 |
| ·引物 | 第82-83页 |
| ·方法 | 第83-89页 |
| ·ZS-1T2029的基本生物学特性研究 | 第83页 |
| ·突变体ZS-1T2029及其ZS-1菌株菌落形成过程的观察 | 第83页 |
| ·ZS-1T2029 T-DNA插入位点数分析 | 第83页 |
| ·T-DNA侧端DNA序列的获得和序列分析 | 第83-84页 |
| ·TAIL-PCR获得T-DNA侧端DNA序列 | 第84页 |
| ·目的片段的回收及纯化 | 第84页 |
| ·回收片段的连接与转化 | 第84页 |
| ·重组质粒的鉴定和序列分析 | 第84页 |
| ·CMCPS1全长cDNA的克隆 | 第84-86页 |
| ·5'端序列的获得 | 第85页 |
| ·3'端序列的获得 | 第85页 |
| ·全长cDNA序列的拼接 | 第85-86页 |
| ·CMCPS1基因拷贝数的验证 | 第86页 |
| ·CMCPS1基因在出发菌株ZS-1中表达情况分析 | 第86页 |
| ·精氨酸、瓜氨酸对突变体ZS-1T2029孢子形成的互补作用 | 第86-87页 |
| ·CMCPS1基因功能的验证 | 第87-88页 |
| ·RNAi特异性沉默CMCPS1载体的构建及转化 | 第87-88页 |
| ·RNAi特异沉默CMCPS1转化子分析 | 第88页 |
| ·多胺对突变体ZS-1T2029产孢的影响 | 第88页 |
| ·一氧化氮供体硝普钠对突变体ZS-1T2029产孢的影响 | 第88-89页 |
| ·一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME对ZS-1菌株产孢的影响 | 第89页 |
| ·ZS-1菌株和突变体ZS-1T2029中一氯化氮产量的检测 | 第89页 |
| 2.结果与分析 | 第89-113页 |
| ·ZS-1T2029菌株的生物学特性 | 第89-92页 |
| ·产孢缺陷型突变体ZS-1T2029及其ZS-1菌株孢子形成过程的比较 | 第92-95页 |
| ·突变体ZS-1T2029中T-DNA为单位点插入 | 第95页 |
| ·氨甲酰磷酸合成酶基因的获得和序列分析 | 第95-96页 |
| ·TAIL-PCR扩增DNA的序列分析及T-DNA标记插入破坏CMCPS1基因位点预测 | 第96-98页 |
| ·CMCPS1全长cDNA的获得 | 第98-104页 |
| ·CMCPS1基因在盾壳霉ZS-1菌株中拷贝数及表达分析 | 第104-105页 |
| ·精氨酸、瓜氨酸恢复产孢缺陷型突变体ZS-1T2029产孢 | 第105-107页 |
| ·CMCPS1基因功能的验证 | 第107-109页 |
| ·一氧化氮供体硝普钠对突变体ZS-1T2029产孢的影响 | 第109页 |
| ·一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME对ZS-1菌株产孢的影响 | 第109-110页 |
| ·盾壳霉产生一氧化氮的检测 | 第110-113页 |
| 3 结论和讨论 | 第113-116页 |
| ·结论 | 第113页 |
| ·讨论 | 第113-116页 |
| 第五章:盾壳霉产孢相关基因磷酸核糖酰胺转移酶CMAMPRS1基因的克隆 | 第116-135页 |
| 1 材料与方法 | 第117-120页 |
| ·材料 | 第117-118页 |
| ·菌株及培养基 | 第117页 |
| ·试剂、药品 | 第117页 |
| ·引物 | 第117-118页 |
| ·方法 | 第118-120页 |
| ·ZS-1T21882的基本生物学特性研究 | 第118页 |
| ·突变体ZS-1T21882及其ZS-1菌株孢子形成过程的观察 | 第118页 |
| ·ZS-1T21882 T-DNA插入位点数分析 | 第118页 |
| ·T-DNA侧端DNA序列的获得和序列分析 | 第118页 |
| ·磷酸核糖酰胺转移酶(CMAMPRS1)基因全长cDNA的克隆 | 第118-119页 |
| ·5'端序列的获得 | 第119页 |
| ·3'端序列的获得 | 第119页 |
| ·全长cDNA序列的拼接 | 第119页 |
| ·CMAMPRS1基因拷贝数的验证 | 第119-120页 |
| ·CMAMPRS1基因在出发菌株ZS-1中表达情况分析 | 第120页 |
| ·次黄嘌呤(hypoxanthine,IMP),AMP、GMP、cAMP对突变体ZS-1T21882孢子形成的互补作用 | 第120页 |
| 2.结果与分析 | 第120-133页 |
| ·ZS-1T21882菌株的生物学特性 | 第120-122页 |
| ·突变体ZS-1T21882及其ZS-1菌株孢子形成过程的观察 | 第122-124页 |
| ·突变体ZS-1T21882中T-DNA为单位点插入 | 第124-125页 |
| ·谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶基因的获得和序列分析 | 第125页 |
| ·TAIL-PCR扩增DNA的序列分析及T-DNA标记插入破坏CMAMPRS1基因 | 第125-129页 |
| ·CMAMPRS1基因在盾壳霉ZS-1菌株中拷贝数的分析 | 第129-130页 |
| ·CMAMPRS1基因在盾壳霉ZS-1菌株的表达分析 | 第130-131页 |
| ·次黄嘌呤(hyphxanthine,IMP),AMP、GMP、cAMP对产孢缺陷型突变体ZS-1T21882孢子的恢复 | 第131-133页 |
| 3 结论和讨论 | 第133-135页 |
| ·结论 | 第133-134页 |
| ·讨论 | 第134-135页 |
| 第六章 其它几大类突变体的筛选及研究 | 第135-144页 |
| 1 材料与方法 | 第136-137页 |
| ·材料 | 第136页 |
| ·菌株 | 第136页 |
| ·培养基的配置 | 第136页 |
| ·酶、载体、试剂盒及其它试剂 | 第136页 |
| ·方法 | 第136-137页 |
| ·产生抗真菌物质能力加强突变体的筛选 | 第136页 |
| ·产生抗细菌物质能力丧失突变体的筛选 | 第136-137页 |
| ·不寄生菌核的突变体 | 第137页 |
| ·产色素变化突变体的筛选 | 第137页 |
| ·高pH值敏感的突变体筛选 | 第137页 |
| 2.结果与分析 | 第137-142页 |
| ·产生抗真菌物质能力加强突变体的筛选 | 第137-138页 |
| ·产生抗细菌物质能力丧失突变体的筛选 | 第138-139页 |
| ·不寄生菌核的突变体的筛选 | 第139-140页 |
| ·产色素变化突变体的筛选 | 第140-141页 |
| ·高pH值敏感的突变体筛选 | 第141-142页 |
| 3.结论与讨论 | 第142-144页 |
| ·结论 | 第142页 |
| ·讨论 | 第142-144页 |
| 结论与展望 | 第144-147页 |
| 参考文献 | 第147-170页 |
| 致谢 | 第170-171页 |
| 附录1 各种溶液、培养基、试剂及所用药品的配方 | 第171-176页 |
| 附录2 产孢缺陷型突变体的筛选结果及分类 | 第176-180页 |
| 附录3 已发表的相关文章 | 第180-181页 |
