| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-15页 |
| 缩略词表 | 第15-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-44页 |
| ·毕赤酵母介绍 | 第16-19页 |
| ·毕赤酵母表达宿主菌 | 第16-17页 |
| ·毕赤酵母表达载体 | 第17-18页 |
| ·毕赤酵母表达条件 | 第18页 |
| ·毕赤酵母表达系统的优势 | 第18-19页 |
| ·微生物表面展示技术介绍 | 第19-41页 |
| ·噬菌体展示系统介绍 | 第20-22页 |
| ·细菌表面展示系统介绍 | 第22-31页 |
| ·酵母表面展示系统介绍 | 第31-41页 |
| ·毕赤酵母表面展示系统介绍 | 第41页 |
| ·绿色荧光蛋白介绍 | 第41-42页 |
| ·本论文的研究工作 | 第42-44页 |
| 第二章 Pir1型毕赤酵母表面展示系统的构建及表达研究 | 第44-88页 |
| ·实验材料 | 第44-52页 |
| ·菌株和质粒 | 第44页 |
| ·主要试剂 | 第44-45页 |
| ·培养基 | 第45-46页 |
| ·主要仪器 | 第46-47页 |
| ·主要试剂配方 | 第47-52页 |
| ·实验流程 | 第52-53页 |
| ·实验方法 | 第53-65页 |
| ·酿酒酵母(S.cerevisiae EBY100)基因组的提取 | 第53页 |
| ·目的基因的扩增 | 第53-54页 |
| ·PCR Fragment Purification Kit回收纯化目的基因片段 | 第54-55页 |
| ·pPIC9K质粒的提取 | 第55页 |
| ·酶切与回收片段 | 第55-56页 |
| ·目的基因和载体连接 | 第56-57页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第57页 |
| ·连接产物的大肠杆菌转化 | 第57页 |
| ·重组子筛选与鉴定 | 第57-58页 |
| ·增强型绿色荧光蛋白基因的扩增 | 第58-59页 |
| ·增强型绿色荧光蛋白基因与pPIC9K-Pir1-a质粒的双酶切 | 第59页 |
| ·重组质粒pPIC9K-Pir1-a-EGFP的构建 | 第59页 |
| ·重组质粒线性化 | 第59-60页 |
| ·毕赤酵母电转化感受态细胞的制备 | 第60页 |
| ·毕赤酵母电转化 | 第60-61页 |
| ·毕赤酵母重组转化子的筛选 | 第61-62页 |
| ·重组毕赤酵母菌株的表达 | 第62页 |
| ·免疫荧光分析 | 第62-63页 |
| ·酵母细胞壁融合蛋白的提取[147] | 第63页 |
| ·发酵液的浓缩处理 | 第63页 |
| ·Western-blot检测融合蛋白的定位 | 第63-64页 |
| ·荧光分光光度计分析表面展示的增强型绿色荧光蛋白荧光强度 | 第64页 |
| ·流式细胞仪分析增强型绿色荧光蛋白细胞表面锚定情况 | 第64-65页 |
| ·实验结果 | 第65-82页 |
| ·以Pir1-a为锚定蛋白、增强型绿色荧光蛋白为模式蛋白的毕赤酵母展示系统的构建 | 第65-73页 |
| ·以Pir1-b为锚定蛋白、增强型绿色荧光蛋白为模式蛋白的毕赤酵母展示系统的构建 | 第73-79页 |
| ·Western blot分析融合蛋白EGFP-Pir1-a与EGFP-Pir1-b的细胞定位 | 第79-81页 |
| ·荧光分光光度计分析展示在毕赤酵母表面的增强型绿色荧光蛋白的相对荧光强度 | 第81页 |
| ·流式细胞仪分析毕赤酵母表面展示的增强型绿色荧光蛋白的相对荧光强度 | 第81-82页 |
| ·讨论 | 第82-86页 |
| ·毕赤酵母表面展示系统的优点 | 第82-83页 |
| ·已建立的毕赤酵母表面展示系统的不足 | 第83-84页 |
| ·本研究的工作及意义 | 第84-86页 |
| ·本章小结 | 第86-88页 |
| 第三章 α凝集素型毕赤酵母表面展示系统的构建及毕赤酵母表达重组蛋白纯化新方法的探讨 | 第88-102页 |
| ·实验材料 | 第88-90页 |
| ·菌株和质粒 | 第88-89页 |
| ·主要试剂 | 第89页 |
| ·培养基 | 第89页 |
| ·主要仪器 | 第89页 |
| ·主要试剂配方 | 第89-90页 |
| ·实验流程 | 第90-91页 |
| ·实验方法 | 第91-92页 |
| ·α凝集素的C末端基因的克隆 | 第91页 |
| ·PCR Fragment Purification Kit回收纯化目的基因片段 | 第91-92页 |
| ·pPIC9K-AGα1、pPEGFP重组质粒的构建、验证、线性化、电转毕赤酵母、重组毕赤酵母转化子验证、表达、免疫荧光分析 | 第92页 |
| ·肠激酶酶切展示在表面的增强型绿色荧光蛋白 | 第92页 |
| ·Western blot分析肠激酶作用效果 | 第92页 |
| ·实验结果 | 第92-99页 |
| ·重组载体构建示意图 | 第92-93页 |
| ·重组质粒pPIC9K-AGα1的构建 | 第93-95页 |
| ·重组质粒pPEGFP的构建 | 第95页 |
| ·重组毕赤酵母表达菌株的构建与筛选 | 第95-96页 |
| ·增强型绿色荧光蛋白与α凝集素C末端的融合蛋白在毕赤酵母中表达与免疫荧光鉴定 | 第96-97页 |
| ·肠激酶酶切表面展示的增强型绿色荧光蛋白 | 第97-98页 |
| ·Western blot分析肠激酶作用效果 | 第98-99页 |
| ·讨论 | 第99-101页 |
| ·发展可选择分离表面展示的外源蛋白的新型毕赤酵母表面展示系统的意义 | 第99-100页 |
| ·本研究的工作及意义 | 第100-101页 |
| ·本章小结 | 第101-102页 |
| 第四章 两种毕赤酵母表面展示系统展示外源蛋白能力的比较 | 第102-114页 |
| ·实验材料 | 第102-103页 |
| ·实验菌株 | 第102页 |
| ·培养基 | 第102-103页 |
| ·主要仪器 | 第103页 |
| ·实验方法 | 第103-104页 |
| ·培养条件 | 第103-104页 |
| ·荧光分光光度计分析表面展示的增强型绿色荧光蛋白荧光强度 | 第104页 |
| ·实验结果 | 第104-110页 |
| ·诱导温度对融合蛋白表达的影响 | 第104-106页 |
| ·不同pH对融合蛋白表达的影响 | 第106-108页 |
| ·甲醇诱导浓度对融合蛋白表达的影响 | 第108-110页 |
| ·实验讨论 | 第110-112页 |
| ·毕赤酵母展示外源融合蛋白影响因素的优化 | 第110-111页 |
| ·绿色荧光蛋白作为报告基因在蛋白表达中的应用 | 第111-112页 |
| ·本章小结 | 第112-114页 |
| 参考文献 | 第114-130页 |
| 致谢 | 第130-132页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第132-134页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第134-135页 |
| 附:英文文章 | 第135-147页 |
