| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 英文缩略词表 | 第9-11页 |
| 1 前言 | 第11-15页 |
| 2 材料与方法 | 第15-33页 |
| ·材料与仪器 | 第15-18页 |
| ·菌种和质粒 | 第15页 |
| ·主要试剂 | 第15-16页 |
| ·其它主要试剂的配方 | 第16-17页 |
| ·主要仪器 | 第17-18页 |
| ·技术路线 | 第18-20页 |
| ·方法 | 第20-33页 |
| ·tPA的改造 | 第20-25页 |
| ·表达载体pBC1-tPA的构建 | 第25-28页 |
| ·表达载体pYLSV-pBC1-tPA的构建 | 第28-29页 |
| ·BAC-TDN-PT-GD打靶载体的构建 | 第29-32页 |
| ·多位点打靶载体BAC-TDN-PT-GD转染胎牛成纤维细胞 | 第32-33页 |
| 3 结果与分析 | 第33-41页 |
| ·tPA的改造 | 第33-35页 |
| ·片段A、B、C、D的PCR扩增 | 第33页 |
| ·片段AB的拼接 | 第33-34页 |
| ·片段ABC的拼接 | 第34页 |
| ·片段ABCD的拼接 | 第34-35页 |
| ·突变htPA测序 | 第35页 |
| ·小结 | 第35页 |
| ·表达载体pBC1-tPA的构建 | 第35-37页 |
| ·插入基因htPA的PCR扩增 | 第35-36页 |
| ·载体酶切鉴定 | 第36页 |
| ·htPA插入顺序鉴定 | 第36-37页 |
| ·表达载体pYLSV-pBC1-tPA的构建 | 第37-38页 |
| ·PCR扩增 | 第37页 |
| ·载体酶切鉴定 | 第37-38页 |
| ·BAC-TDN-PT-GD打靶载体的构建 | 第38-40页 |
| ·混收质粒鉴定 | 第38页 |
| ·打靶载体SV骨架切除 | 第38-39页 |
| ·打靶载体PCR扩增鉴定 | 第39-40页 |
| ·多位点打靶载体BAC-TDN-PT-GD转染胎牛成纤维细胞 | 第40-41页 |
| 4 讨论 | 第41-51页 |
| ·运用重叠PCR技术构建定点突变hiPA | 第41-43页 |
| ·基因打靶定点整合的原理与基因打靶载体的构建策略 | 第43-44页 |
| ·基因打靶定点整合的原理 | 第43页 |
| ·打靶载体的正负选择系统的建立 | 第43-44页 |
| ·大分子量载体的操作 | 第44-47页 |
| ·转化 | 第44-45页 |
| ·快速鉴定 | 第45-47页 |
| ·tPA的选择及改造 | 第47-48页 |
| ·奶牛乳腺生物反应器及β-酪蛋白调控序列 | 第48-49页 |
| ·应用前景 | 第49-51页 |
| 5 结论 | 第51-52页 |
| 6 附录 | 第52-56页 |
| 附录1 人类组织型纤溶酶原激活剂tPA全序列 | 第52-55页 |
| 附录2 改造后的htPA测序结果 | 第55-56页 |
| 7 参考文献 | 第56-59页 |
| 致谢 | 第59页 |