| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一部分 前言 | 第9-20页 |
| 1 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)研究进展 | 第9-15页 |
| ·苏云金芽胞杆菌晶体毒蛋白的分类 | 第9-11页 |
| ·苏云金芽胞杆菌晶体毒蛋白的结构、功能及作用机理 | 第11-13页 |
| ·苏云金芽胞杆菌的抗性对策研究 | 第13-15页 |
| ·抗性管理研究 | 第13-14页 |
| ·转基因植物和工程菌的构建 | 第14-15页 |
| ·融合基因的构建 | 第15页 |
| 2 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统简介 | 第15-20页 |
| ·巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统的优点 | 第16-17页 |
| ·影响毕赤酵母(Pichia pastoris)中外源蛋白表达的因素及优化策略 | 第17-20页 |
| ·外源基因序列的内在特性 | 第17-18页 |
| ·表达条件 | 第18-20页 |
| 第二部分 实验部分 | 第20-47页 |
| 1 实验材料 | 第20-24页 |
| ·菌株与质粒 | 第20页 |
| ·供试昆虫 | 第20页 |
| ·酶与试剂 | 第20页 |
| ·培养基及储备液 | 第20-22页 |
| ·培养基 | 第20-22页 |
| ·储备液 | 第22页 |
| ·试剂与缓冲液 | 第22-23页 |
| ·质粒抽提试剂 | 第22页 |
| ·质粒快速检测试剂 | 第22页 |
| ·酵母总DNA抽提液 | 第22页 |
| ·SDS-PAGE电泳试剂 | 第22-23页 |
| ·蛋白质浓度测定试剂 | 第23页 |
| ·常用储液 | 第23-24页 |
| 2 实验方法 | 第24-30页 |
| ·pMD-cryIAb/Ac质粒的构建 | 第24-26页 |
| ·pUC18-cryIAb/Ac质粒的抽提及纯化 | 第24页 |
| ·引物设计与PCR扩增 | 第24-25页 |
| ·凝胶回收PCR产物 | 第25页 |
| ·目的基因连接到pMD-18T载体 | 第25页 |
| ·大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞的制备 | 第25-26页 |
| ·大肠杆菌(E.coli)DH5α的转化 | 第26页 |
| ·大肠杆菌质粒的快速检测 | 第26页 |
| ·cryIAb/Ac基因的PCR检测 | 第26页 |
| ·重组质粒pPIC9K-cryIAb/Ac的构建 | 第26-27页 |
| ·重组质粒pMD-cryIAb/Ac和穿梭载体pPIC9K的抽提 | 第26-27页 |
| ·重组质粒pMD-cryIAb/Ac和穿梭载体pPIC9K的线性化及纯化回收 | 第27页 |
| ·表达载体pPIC9K-cryIAb/Ac的构建 | 第27页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备及转化 | 第27-29页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第27页 |
| ·线性化重组质粒pPIC9K-cryIAb/Ac | 第27页 |
| ·毕赤酵母的电转化 | 第27-28页 |
| ·表达菌株的PCR检测确定 | 第28页 |
| ·cryIAb/Ac基因在毕赤酵母中的诱导表达 | 第28-29页 |
| ·SDS-PAGE凝胶的制备及发酵上清液的SDS-PAGE电泳分析 | 第29页 |
| ·SDS-PAGE凝胶的制备 | 第29页 |
| ·SDS-PAGE电泳分析 | 第29页 |
| ·重组酵母CryIAb/Ac毒蛋白杀虫活性检测 | 第29-30页 |
| ·Lowry法检测重组酵母CryIAb/Ac毒蛋白含量 | 第29-30页 |
| ·以甜菜夜蛾1龄幼虫做杀虫活性测定 | 第30页 |
| ·以二化螟2龄幼虫做杀虫活性测定 | 第30页 |
| 3 实验结果与分析 | 第30-45页 |
| ·Bt毒蛋白CrylAb/Ac基因的PCR扩增 | 第30-31页 |
| ·Bt毒蛋白crylAb/Ac基因在T载体上的克隆 | 第31-38页 |
| ·重组质粒pPIC9K-CryIAb/Ac的构建及鉴定 | 第38-40页 |
| ·酵母的电转化及重组子的筛选 | 第40-42页 |
| ·重组质粒的pPIC9K-CryIAb/Ac的线性化 | 第40-41页 |
| ·重组子的筛选 | 第41-42页 |
| ·重组酵母总DNA中的CryIAb/Ac基因PCR检测 | 第42页 |
| ·CryIAb/Ac基因的诱导培养及SDS-PAGE电泳分析 | 第42-43页 |
| ·CryIAb/Ac毒蛋白含量检测 | 第43-45页 |
| ·CryIAb/Ac毒蛋白杀虫活性检测 | 第45页 |
| 4 小结 | 第45-46页 |
| 5 讨论 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-57页 |
| 致谢 | 第57页 |
