| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 引言 | 第10-12页 |
| 材料与方法 | 第12-15页 |
| 1 材料 | 第12-13页 |
| ·细胞株、质粒 | 第12页 |
| ·试剂及仪器 | 第12-13页 |
| ·细胞培养试剂 | 第13页 |
| 2 方法 | 第13-15页 |
| ·细胞转染 | 第13页 |
| ·PRB亚细胞定位的观察 | 第13-14页 |
| ·荧光素酶活性测定 | 第14页 |
| ·PRB的转录活性的测定 | 第14-15页 |
| 结果与讨论 | 第15-20页 |
| 1.PRB亚细胞定位的观察 | 第15-16页 |
| 2.PRB转录激活测试系统的建立 | 第16-17页 |
| 3.PIAS3抑制外源PRB的转录活性 | 第17-18页 |
| 4.PIAS3对PRB转录活性的抑制依赖孕激素 | 第18-19页 |
| 小结 | 第19-20页 |
| 第二部分 酵母双杂交技术验证PIAS3与PRB的相互作用 | 第20-29页 |
| 材料与方法 | 第20-25页 |
| 1 材料及来源 | 第20页 |
| ·菌株和质粒 | 第20页 |
| ·主要试剂 | 第20页 |
| 2 实验方法 | 第20-25页 |
| ·PRB酵母表达载体的构建 | 第20-21页 |
| ·PIAS3酵母表达载体的构建 | 第21页 |
| ·PCR扩增目的片段 | 第21-22页 |
| ·酶切PCR产物和载体 | 第22页 |
| ·连接 | 第22-23页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第23页 |
| ·质粒提取、酶切片段的鉴定 | 第23页 |
| ·Western blot分析 | 第23-24页 |
| ·酵母细胞的转化 | 第24-25页 |
| 结果与讨论 | 第25-28页 |
| 1.酵母表达载体的构建及鉴定 | 第25-26页 |
| 2.PRB各种缺失突变体在酵母细胞中的表达鉴定 | 第26页 |
| 3.PIAS3在酵母细胞中自身转录激活活性的测定 | 第26页 |
| 4.PRB及缺失突变体在酵母细胞里与PIAS3的结合 | 第26-28页 |
| 小结 | 第28-29页 |
| 第三部分 PRB与PIAS3相互作用的进一步验证 | 第29-39页 |
| 材料与方法 | 第29-34页 |
| 1 试剂、材料及仪器 | 第29-30页 |
| ·质粒、菌株、细胞株 | 第29页 |
| ·主要试剂 | 第29页 |
| ·细胞培养试剂 | 第29-30页 |
| ·抗体 | 第30页 |
| ·大型仪器 | 第30页 |
| 2 方法 | 第30-34页 |
| ·GST融合表达载体的构建 | 第30-31页 |
| ·COS7、293T细胞瞬时转染 | 第31页 |
| ·GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第31页 |
| ·GST沉淀(pull-down)分析 | 第31-32页 |
| ·免疫共沉淀 | 第32页 |
| ·亚细胞定位分析 | 第32-34页 |
| 结果与讨论 | 第34-38页 |
| 1.GST表达载体的构建及鉴定 | 第34页 |
| 2.GST融合蛋白的表达鉴定及其纯化 | 第34-35页 |
| 3.PRB与PIAS3相互作用的验证 | 第35页 |
| ·PRB与PIAS3在体外的相互作用 | 第35-36页 |
| ·PRB与PIAS3在体内的相互作用 | 第36页 |
| ·PRB与PIAS3在活细胞内的相互作用 | 第36-38页 |
| 小结 | 第38-39页 |
| 第四部分 PIAS3抑制PRB活性的机制 | 第39-45页 |
| 材料与方法 | 第39-42页 |
| 1 材料 | 第39-40页 |
| ·细胞株、质粒 | 第39页 |
| ·试剂及仪器 | 第39-40页 |
| ·PRB的SUMO化点突变体的构建 | 第40页 |
| 2 方法 | 第40-42页 |
| ·细胞转染 | 第40-41页 |
| ·荧光素酶活性测定 | 第41页 |
| ·Western blot分析 | 第41-42页 |
| 结果与讨论 | 第42-44页 |
| 1.PIAS3对PRB及其点突变体转录激活活性的影响 | 第42页 |
| 2.PRB SUMO化的western分析 | 第42-43页 |
| 3.PRB点突变体SUMO化的western分析 | 第43-44页 |
| 小结 | 第44-45页 |
| 总结 | 第45-46页 |
| 参考文献 | 第46-48页 |
| 致谢 | 第48-49页 |
| 附录 | 第49页 |
| 英文缩略词 | 第49-51页 |
| 文章发表与交流 | 第51-58页 |
