| 引言 | 第1-25页 |
| 一、马传染性贫血病病毒概述 | 第13-21页 |
| 1 国内外EIAV毒株及特性 | 第14页 |
| 2 gag基因及其编码蛋白 | 第14-16页 |
| 3 pol基因及其编码产物 | 第16页 |
| 4 env基因及其编码产物 | 第16-18页 |
| 4．1 表面蛋白(SU／gp90) | 第16-17页 |
| 4．2 跨膜蛋白(TM／gp45) | 第17-18页 |
| 5 调节蛋白及其编码区 | 第18-21页 |
| 5．1 Tat蛋白及其作用元件TAR | 第18-19页 |
| 5．2 S2开放阅读框架(ORF) | 第19页 |
| 5．3 S3开放阅读框架和Rev蛋白 | 第19-20页 |
| 5．4 EIAV的非编码区——LTR | 第20-21页 |
| 二、慢病毒与糖基化 | 第21-25页 |
| 1 SIV与糖基化 | 第22-23页 |
| 2 HIV与糖基化 | 第23-25页 |
| 三、本研究的主要内容和意义 | 第25页 |
| 研究报告 | 第25-63页 |
| 实验一 EIAV-DLA株与其亲本强毒EIAV-L株env基因及S2基因变异分析 | 第25-36页 |
| 1 材料 | 第26-27页 |
| 1．1 毒株 | 第27页 |
| 1．2 质粒和菌株 | 第27页 |
| 1．3 试剂 | 第27页 |
| 1．4 质粒的小量提取 | 第27页 |
| 2 方法 | 第27-29页 |
| 2．1 驴白细胞的培养 | 第27-28页 |
| 2．2 EIAV病毒RNA的提取 | 第28页 |
| 2．3 强、弱毒包含完整S2和gp90基因的扩增 | 第28-29页 |
| 2．4 强、弱毒代表性gp90部分基因的原核表达载休克隆的构建 | 第29页 |
| 2．5 强、弱毒部分gp90蛋白的表达 | 第29页 |
| 3 结果 | 第29-36页 |
| 3．1 包含完整S2和gp90基因的克隆与鉴定 | 第29页 |
| 3．2 EIAV-DLA及EIAV-L株gp90核苷酸和氨基酸序列比较 | 第29-30页 |
| 3．3 从EIAV-L株到DLA后gp90氨基酸比较 | 第30-34页 |
| 3．4 从EIAV-L株到DLA后gp90氨基酸点突变 | 第34页 |
| 3．5 EIAV-DLA及EIAV-L株S2基因核苷酸和氨基酸序列比较 | 第34-35页 |
| 3．6 EIAV-DLA及EIAV-L株S2基因氨基酸变异分析 | 第35页 |
| 3．7 强弱毒代表性gp90部分基因的原核表达 | 第35-36页 |
| 实验二 马传染性贫血强、弱毒gp90在真核细胞系中的稳定表达 | 第36-45页 |
| 1 材料 | 第37-39页 |
| 1．1 菌株及细胞系 | 第37页 |
| 1．2 质粒 | 第37-38页 |
| 1．3 试剂 | 第38页 |
| 1．4 细胞培养用试剂 | 第38-39页 |
| 1．4．1 Hank's液 | 第38-39页 |
| 1．4．2 0.25％胰酶 | 第39页 |
| 1．5 仪器设备 | 第39页 |
| 2 方法 | 第39-41页 |
| 2．1 重组逆转录病毒载体的构建 | 第39页 |
| 2．2 重组真核表达载体的构建 | 第39页 |
| 2．3 转染用质粒的纯化 | 第39-41页 |
| 2．4 重组逆转录病毒的产生 | 第41页 |
| 2．5 表达EIAV gp90的SP20的产生 | 第41页 |
| 2．6 RT-PCR检测EIAV gp90在SP-20中的表达 | 第41页 |
| 2．7 表达EIAV gp90的293T细胞系的产生 | 第41页 |
| 2．8 免疫荧光检测EIAV gp90在293T细胞系的表达 | 第41页 |
| 3 结果 | 第41-45页 |
| 3．1 包含强、弱毒gp90重组逆转录病毒载体的构建 | 第41-42页 |
| 3．2 包含强、弱毒gp90重组真核表达载体的构建 | 第42页 |
| 3．3 强、弱毒gp90重组逆转录病毒的制备 | 第42-43页 |
| 3．4 强、弱毒gp90在SP-20中的表达 | 第43页 |
| 3．5 表达强、弱毒gp90真核细胞系293T的筛选 | 第43-45页 |
| 实验三 EIAV一系列N-连接糖基化突变克隆和嵌合感染性分子克隆的构建及生物学特性研究 | 第45-63页 |
| 1 材料 | 第46-48页 |
| 1．1 质粒和菌株 | 第46页 |
| 1．2 试剂 | 第46页 |
| 1．3 引物的合成和克隆或者亚克隆片段的序列测定 | 第46页 |
| 1．4 驴白细胞的分离培养及FDD细胞、EFK细胞的培养 | 第46页 |
| 1．5 主要仪器 | 第46页 |
| 1．6 质粒的提取与纯化 | 第46-48页 |
| 1．6．1 质粒的小量提取 | 第47页 |
| 1．6．2 质粒的大量提取和纯化 | 第47-48页 |
| 2 方法 | 第48-54页 |
| 2．1 pOK-LTR-DLA／L、pOK-env-DLA／L和pOK-LTRenv-DLA／L嵌合分子克隆的构建 | 第48-49页 |
| 2．2 N-连接糖基化突变分子克隆的构建 | 第49-51页 |
| 2．2．1 N-191，N-236，N-246突变分子克隆的构建 | 第49-50页 |
| 2．2．2 N-191+N-236，N-191+N-246，N-236+N-246突变分子克隆的构建 | 第50页 |
| 2．2．3 N-191+N-236+N-246突变分子克隆的构建 | 第50-51页 |
| 2．3 转染 | 第51页 |
| 2．4 转录酶(RT)活性的测定 | 第51-53页 |
| 2．5 电镜观察 | 第53页 |
| 2．6 嵌合病毒前病毒基因组的提取 | 第53页 |
| 2．7 嵌合病毒前病毒基因组LTR的扩增及测序 | 第53页 |
| 2．8 动物试验 | 第53-54页 |
| 2．9 血清抗体的检测 | 第54页 |
| 3 结果 | 第54-63页 |
| 3．1 重组质粒pOK-LTR-DLA／L的构建 | 第54-55页 |
| 3．2 重组质粒pOK-env-DLA／L的构建 | 第55页 |
| 3．3 重组质粒pOK-LTRenv-DLA／L的构建 | 第55-56页 |
| 3．4 N-191，N-236，N-246突变分子克隆的获得 | 第56-57页 |
| 3．5 N-191+N-236，N-191+N-246，N-236+N-246突变分子克隆的获得 | 第57页 |
| 3．6 N-191+N-236+N-246突变分子克隆的获得 | 第57页 |
| 3．7 马传染性贫血病毒感染性分子克隆衍生病毒的获得 | 第57-59页 |
| 3．8 嵌合病毒LTR的扩增及鉴定 | 第59页 |
| 3．9 人工感染马临床表现及血清学检测 | 第59-63页 |
| 讨论 | 第63-71页 |
| 1 EIAV env及S2基因变异及其生物学意义 | 第63-67页 |
| 2 LTR变异对EIAV毒力及细胞嗜性的影响 | 第67-68页 |
| 3 EIAV env基因点突变对病毒的复制影响及其它结构蛋白特异性抗体对试验马致病性的影响 | 第68-71页 |
| 结论 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-79页 |
| 附录 | 第79-87页 |
| 致谢 | 第87-88页 |
| 作者简介 | 第88页 |
