| 致谢 | 第4-11页 |
| 摘要 | 第11-12页 |
| 文献综述 | 第12-19页 |
| 1 猪繁殖与呼吸综合征概述 | 第12页 |
| 2 病原学 | 第12-14页 |
| 2.1 PRRSV病原学特性 | 第12页 |
| 2.2 PRRSV基因组结构 | 第12页 |
| 2.3 PRRSV编码的蛋白及功能 | 第12-14页 |
| 2.3.1 结构蛋白 | 第12-14页 |
| 2.3.2 非结构蛋白 | 第14页 |
| 3 流行病学 | 第14-15页 |
| 3.1 传染源 | 第14页 |
| 3.2 传播途径 | 第14-15页 |
| 3.3 流行特征 | 第15页 |
| 3.4 临床症状 | 第15页 |
| 3.5 病理变化 | 第15页 |
| 4 诊断方法 | 第15-17页 |
| 4.1 血清学诊断方法 | 第15-16页 |
| 4.1.1 间接荧光抗体试验(IFA) | 第15页 |
| 4.1.2 血清中和试验(SNT) | 第15-16页 |
| 4.1.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第16页 |
| 4.1.4 荧光微珠免疫检测方法(FMIA) | 第16页 |
| 4.1.5 免疫过氧化物酶单层试验(IPMA) | 第16页 |
| 4.2 免疫胶体金技术 | 第16页 |
| 4.3 分子生物学诊断方法 | 第16-17页 |
| 4.3.1 RT-PCR检测 | 第16页 |
| 4.3.2 实时荧光定量PCR(real-timePCR) | 第16页 |
| 4.3.3 逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP) | 第16页 |
| 4.3.4 原位杂交技术(ISH) | 第16页 |
| 4.3.5 基因芯片技术 | 第16-17页 |
| 4.4 病毒的分离鉴定 | 第17页 |
| 5 猪繁殖与呼吸综合征疫苗 | 第17-19页 |
| 5.1 灭活疫苗 | 第17页 |
| 5.2 弱毒疫苗(MLVs) | 第17页 |
| 5.3 基因工程苗 | 第17-19页 |
| 5.3.1 标记疫苗 | 第17页 |
| 5.3.2 核酸(DNA)疫苗 | 第17页 |
| 5.3.3 亚单位疫苗 | 第17-18页 |
| 5.3.4 活载体疫苗 | 第18-19页 |
| 引言 | 第19-21页 |
| 实验一 华南地区PRRS流行病学调查及ORF5与Nsp2基因遗传进化分析 | 第21-41页 |
| 1 材料和方法 | 第21-27页 |
| 1.1 材料 | 第21-24页 |
| 1.1.1 试剂 | 第21页 |
| 1.1.2 样品来源 | 第21页 |
| 1.1.3 主要仪器 | 第21-22页 |
| 1.1.4 相关溶液的配制 | 第22页 |
| 1.1.5 引物设计与合成 | 第22页 |
| 1.1.6 分子生物学分析软件 | 第22页 |
| 1.1.7 用于本研究的PRRSV毒株基因组序列 | 第22-24页 |
| 1.2 方法 | 第24-27页 |
| 1.2.1 样品准备 | 第24-25页 |
| 1.2.2 待检血清样品中PRRSV抗体水平的检测 | 第25页 |
| 1.2.3 组织RNA提取 | 第25-26页 |
| 1.2.4 RT-PCR检测 | 第26页 |
| 1.2.5 测序 | 第26页 |
| 1.2.6 序列比对 | 第26-27页 |
| 1.2.7 遗传演化分析 | 第27页 |
| 2 结果与分析 | 第27-40页 |
| 2.1 2015年华南地区PRRSV抗体检测结果 | 第27-31页 |
| 2.1.1 不同地区送检血清的PRRSV抗体阳性率 | 第27-28页 |
| 2.1.2 不同区域送检血清的PRRSV抗体阳性率 | 第28-29页 |
| 2.1.3 不同阶段猪PRRSV抗体阳性率 | 第29-30页 |
| 2.1.4 不同月份PRRSV抗体阳性率 | 第30-31页 |
| 2.2 2015年华南地区抗原检测结果 | 第31-34页 |
| 2.2.1 不同地区抗原检测结果 | 第32-33页 |
| 2.2.2 不同月份抗原检测结果 | 第33-34页 |
| 2.3 2015年华南地区PRRSV的Nsp2高变区和ORF5基因遗传进化分析 | 第34-40页 |
| 2.3.1 Nsp2基因变异分析 | 第34-37页 |
| 2.3.1.1 Nsp2基因核苷酸及其推导编码的氨基酸相似性比较 | 第34-36页 |
| 2.3.1.2 依据Nsp2基因推导编码的氨基酸序列绘制的遗传演化图 | 第36-37页 |
| 2.3.2 ORF5基因变异分析 | 第37-40页 |
| 2.3.2.1 ORF5基因核苷酸及其推导编码的氨基酸相似性比较 | 第37-39页 |
| 2.3.2.2 依据ORF5基因推导编码的氨基酸序列绘制的遗传演化图 | 第39-40页 |
| 3 讨论 | 第40-41页 |
| 实验二 华南地区种公猪PRRSV分子流行病学调查分析 | 第41-56页 |
| 1 材料和方法 | 第41-45页 |
| 1.1 材料 | 第41-42页 |
| 1.1.1 样品 | 第41页 |
| 1.1.2 主要仪器 | 第41页 |
| 1.1.3 试剂 | 第41-42页 |
| 1.1.4 相关溶液的配制 | 第42页 |
| 1.1.5 载体与菌株 | 第42页 |
| 1.1.6 分子生物学分析软件 | 第42页 |
| 1.2 方法 | 第42-45页 |
| 1.2.1 总RNA提取 | 第42页 |
| 1.2.2 引物合成 | 第42页 |
| 1.2.3 用于本研究的PRRSV毒株基因组序列 | 第42页 |
| 1.2.4 cDNA模板制备 | 第42-43页 |
| 1.2.4.1 RNA的热变性 | 第42-43页 |
| 1.2.4.2 反应液配制 | 第43页 |
| 1.2.4.3 逆转录反应条件 | 第43页 |
| 1.2.5 PCR扩增 | 第43页 |
| 1.2.5.1 PRRSV的Nsp2基因片段的扩增 | 第43页 |
| 1.2.5.2 PRRSV的GP5基因片段的扩增 | 第43页 |
| 1.2.6 PCR产物的纯化回收 | 第43-44页 |
| 1.2.7 PCR纯化产物的克隆与序列测定 | 第44页 |
| 1.2.7.1 重组连接 | 第44页 |
| 1.2.7.2 连接物的转化 | 第44页 |
| 1.2.7.3 阳性克隆检测 | 第44页 |
| 1.2.7.4 测序 | 第44页 |
| 1.2.8 序列比对 | 第44页 |
| 1.2.9 遗传演化分析 | 第44-45页 |
| 2 结果与分析 | 第45-55页 |
| 2.1 抗体抗原检测结果 | 第45-47页 |
| 2.2 Nsp2高变区和ORF5基因的克隆与测序 | 第47-48页 |
| 2.3 Nsp2高变区基因变异分析 | 第48-51页 |
| 2.3.1 Nsp2高变区核苷酸及其推导编码的氨基酸相似性比较 | 第48-50页 |
| 2.3.2 依据Nsp2基因推导编码的氨基酸序列绘制的遗传演化图 | 第50-51页 |
| 2.4 ORF5基因变异分析 | 第51-55页 |
| 2.4.1 ORF5基因核苷酸及其推导编码的氨基酸相似性比较 | 第51-54页 |
| 2.4.2 依据ORF5基因推导编码的氨基酸序列绘制的遗传演化图 | 第54-55页 |
| 3 讨论 | 第55-56页 |
| 实验三 猪蓝耳病病毒HY毒株的分离纯化及全基因组测序分析 | 第56-71页 |
| 1 材料和方法 | 第56-61页 |
| 1.1 材料 | 第56-58页 |
| 1.1.1 临床样本 | 第56页 |
| 1.1.2 细胞 | 第56页 |
| 1.1.3 载体与菌株 | 第56页 |
| 1.1.4 RT-PCR相关试剂及溶液的配制 | 第56页 |
| 1.1.5 琼脂糖凝胶电泳试剂 | 第56页 |
| 1.1.6 转化用溶液 | 第56页 |
| 1.1.7 细胞培养用溶液 | 第56-57页 |
| 1.1.8 噬斑纯化相关试剂 | 第57页 |
| 1.1.9 主要仪器设备 | 第57-58页 |
| 1.1.10 全基因组测序所需引物 | 第58页 |
| 1.1.11 用于本研究的PRRSV毒株 | 第58页 |
| 1.1.12 分子生物学分析软件 | 第58页 |
| 1.2 方法 | 第58-61页 |
| 1.2.1 病料的处理 | 第58页 |
| 1.2.2 病毒分离 | 第58-59页 |
| 1.2.3 病毒的噬斑纯化 | 第59页 |
| 1.2.4 病毒的RT-PCR鉴定 | 第59页 |
| 1.2.5 病毒滴度的测定 | 第59页 |
| 1.2.6 病毒的全基因组序列测定 | 第59-61页 |
| 1.2.6.1 总RNA提取 | 第59页 |
| 1.2.6.2 cDNA模板制备 | 第59-60页 |
| 1.2.6.3 PCR扩增 | 第60页 |
| 1.2.6.4 PCR产物的纯化回收 | 第60页 |
| 1.2.6.5 PCR纯化产物的克隆与序列测定 | 第60-61页 |
| 1.2.7 序列比对 | 第61页 |
| 1.2.8 遗传演化分析 | 第61页 |
| 2 结果与分析 | 第61-70页 |
| 2.1 PRRSV毒株的分离、纯化与鉴定 | 第61-62页 |
| 2.1.1 毒株分离及噬斑纯化 | 第61-62页 |
| 2.1.2 分离毒株鉴定 | 第62页 |
| 2.2 PRRSVHY株全基因组序列测定与分析 | 第62-63页 |
| 2.3 HY全基因组的分析 | 第63-70页 |
| 2.3.1 HY的Nsp2基因和ORF5基因核苷酸推导编码的氨基酸相似性比较 | 第63-68页 |
| 2.3.2 HY全基因组核苷酸序列的分析 | 第68-70页 |
| 3 讨论 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-82页 |
| ABSTRACT | 第82-83页 |
