| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 中英文缩略词对照 | 第11-12页 |
| 1 文献综述 | 第12-22页 |
| 1.1 猪肺炎支原体的研究概况 | 第12-14页 |
| 1.1.1 病原学 | 第12-13页 |
| 1.1.2 流行病学 | 第13页 |
| 1.1.3 发病机制 | 第13-14页 |
| 1.1.4 临床症状及病理变化 | 第14页 |
| 1.2 猪肺炎支原体基因组结构及主要抗原蛋白 | 第14-16页 |
| 1.2.1 猪肺炎支原体基因组结构 | 第14页 |
| 1.2.2粘附因子P97与P102 | 第14-15页 |
| 1.2.3膜蛋白P46和P65 | 第15-16页 |
| 1.2.4 热休克蛋白Dnak | 第16页 |
| 1.2.5细胞质蛋白P36 | 第16页 |
| 1.3 国内外猪肺炎支原体疫苗研究进展 | 第16-18页 |
| 1.3.1 MPS常规疫苗 | 第17页 |
| 1.3.2 MPS基因工程疫苗 | 第17-18页 |
| 1.4 腺病毒载体的研究进展 | 第18-20页 |
| 1.4.1 重组腺病毒载体的构建策略 | 第20页 |
| 1.4.2 腺病毒载体的大量扩增与纯化 | 第20页 |
| 1.4.3 腺病毒载体的安全性 | 第20页 |
| 1.5 研究的目的与意义 | 第20-22页 |
| 1.5.1 研究目的 | 第20页 |
| 1.5.2 研究意义 | 第20-22页 |
| 2 猪肺炎支原体粘附因子P97全基因的克隆 | 第22-30页 |
| 2.1 试验材料 | 第22-23页 |
| 2.1.1 试验用猪肺炎支原体菌株 | 第22页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第22页 |
| 2.1.3 相关溶液系统配制方法 | 第22-23页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第23页 |
| 2.2 试验方法 | 第23-26页 |
| 2.2.1 Mhp标准株的复苏与扩大培养 | 第23页 |
| 2.2.2 Mhp基因组基因的提取 | 第23-24页 |
| 2.2.3 PCR引物设计与合成 | 第24-25页 |
| 2.2.4 P97全基因的PCR扩增 | 第25-26页 |
| 2.3 结果 | 第26-28页 |
| 2.3.1 Mhp基因组DNA提取浓度测定结果 | 第26-27页 |
| 2.3.2 分段PCR结果 | 第27页 |
| 2.3.3 目的基因P97前与P97后的酶切结果 | 第27页 |
| 2.3.4 连接及P97全基因扩增结果 | 第27-28页 |
| 2.4 讨论 | 第28-30页 |
| 3 穿梭载体pacAd5 Shuttle-P97的构建与P97基因序列分析 | 第30-39页 |
| 3.1 材料 | 第30-31页 |
| 3.1.1 主要试剂 | 第30页 |
| 3.1.2 相关培养基配制 | 第30-31页 |
| 3.2 试验方法 | 第31-33页 |
| 3.2.1 感受态细胞的制备 | 第31页 |
| 3.2.2 腺病毒表达载体质粒的扩增与纯化 | 第31页 |
| 3.2.3 重组穿梭质粒pacAd5 Shuttle-P97的构建 | 第31-33页 |
| 3.2.4 重组穿梭质粒pacAd5 Shuttle-P97的测序与序列分析 | 第33页 |
| 3.3 结果 | 第33-37页 |
| 3.3.1 腺病毒表达载体质粒的扩增纯化结果 | 第33-34页 |
| 3.3.2 穿梭质粒与P97基因双酶切结果 | 第34-35页 |
| 3.3.3 重组穿梭质粒pacAd5 Shuttle-P97的构建 | 第35-36页 |
| 3.3.4 重组穿梭质粒pacAd5 Shuttle-P97的测序结果 | 第36-37页 |
| 3.4 讨论 | 第37-39页 |
| 4 P97基因的定点突变 | 第39-44页 |
| 4.1 材料与方法 | 第39-41页 |
| 4.1.1 材料 | 第39页 |
| 4.1.2 方法 | 第39-41页 |
| 4.2 结果 | 第41-42页 |
| 4.2.1 重叠延伸PCR结果 | 第41-42页 |
| 4.2.2 重组穿梭质粒pacAd5 Shuttle-TB-P97的测序结果与比对 | 第42页 |
| 4.3 讨论 | 第42-44页 |
| 5 重组腺病毒pacAd5-P97的构建 | 第44-60页 |
| 5.1 材料 | 第44-46页 |
| 5.1.1 试验材料 | 第44页 |
| 5.1.2 细胞培养及转染相关试剂 | 第44页 |
| 5.1.3 RNA提取与反转录相关试剂 | 第44页 |
| 5.1.4 免疫印迹相关试剂 | 第44-45页 |
| 5.1.5 免疫荧光相关试剂 | 第45页 |
| 5.1.6 主要仪器 | 第45页 |
| 5.1.7 主要溶液系统配制 | 第45-46页 |
| 5.2 方法 | 第46-52页 |
| 5.2.1 腺病毒载体表达系统相关质粒的PacⅠ酶切 | 第46页 |
| 5.2.2 包装细胞AD293细胞的复苏与培养 | 第46-47页 |
| 5.2.3 转染 | 第47-48页 |
| 5.2.4 重组腺病毒Ad-P97的反转录PCR(RT-PCR)鉴定 | 第48-49页 |
| 5.2.5 免疫印迹(Western-blot)检测P97蛋白的表达 | 第49-51页 |
| 5.2.6 重组腺病毒Ad-P97和Ad-GFP在PK15细胞中的表达 | 第51页 |
| 5.2.7 重组腺病毒Ad-P97以及Ad-GFP的大量扩增及滴度测定 | 第51-52页 |
| 5.3 结果 | 第52-58页 |
| 5.3.1 腺病毒载体表达系统质粒的PacⅠ单酶切 | 第52页 |
| 5.3.2 重组腺病毒Ad-P97与Ad-GFP的构建 | 第52-54页 |
| 5.3.3 重组腺病毒的鉴定结果 | 第54-57页 |
| 5.3.4 重组腺病毒的滴度测定结果 | 第57-58页 |
| 5.4 讨论 | 第58-60页 |
| 6 重组腺病毒疫苗Ad-P97的免疫效果初步评价 | 第60-69页 |
| 6.1 材料 | 第60-61页 |
| 6.1.1 试验材料 | 第60页 |
| 6.1.2 试验动物及分组 | 第60页 |
| 6.1.3 主要试剂及耗材 | 第60页 |
| 6.1.4 主要仪器 | 第60页 |
| 6.1.5 相关溶液系统配制 | 第60-61页 |
| 6.2 方法 | 第61-64页 |
| 6.2.1 Ad-P97的小鼠免疫及其免疫效果评价 | 第61-63页 |
| 6.2.2 Ad-P97抗血清对Mhp黏附宿主细胞的阻断作用 | 第63-64页 |
| 6.2.3 Ad-P97对仔猪免疫效果测定 | 第64页 |
| 6.3 结果 | 第64-67页 |
| 6.3.1 小鼠淋巴细胞转化试验结果 | 第64-65页 |
| 6.3.2 免疫小鼠血清中P97抗体水平 | 第65页 |
| 6.3.3 Ad-P97抗血清对Mhp黏附PK15细胞的阻断作用 | 第65-66页 |
| 6.3.4 玻片凝集试验检测仔猪血清抗体水平 | 第66-67页 |
| 6.4 讨论 | 第67-69页 |
| 7 结论 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-79页 |
| 附录 | 第79-90页 |
| 致谢 | 第90-91页 |
| 作者简介 | 第91-92页 |
| 导师简介 | 第92页 |
