| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第15-37页 |
| 1.1 G蛋白偶联受体 | 第15-17页 |
| 1.2 大麻素与大麻素受体 | 第17-29页 |
| 1.2.1 大麻素 | 第17-18页 |
| 1.2.2 大麻素受体 | 第18-20页 |
| 1.2.2.1 器官分布 | 第18页 |
| 1.2.2.2 氨基酸序列 | 第18-19页 |
| 1.2.2.3 大麻素受体结构 | 第19-20页 |
| 1.2.3 大麻素受体的激动剂和拮抗剂 | 第20-21页 |
| 1.2.3.1 大麻素受体的激动剂 | 第20页 |
| 1.2.3.2 大麻素受体的拮抗剂 | 第20-21页 |
| 1.2.4 受体内吞 | 第21页 |
| 1.2.5 信号转导机制 | 第21-27页 |
| 1.2.5.1 CB1介导的下游信号通路ERK1/ | 第22-25页 |
| 1.2.5.2 CB1介导的下游cAMP信号通路 | 第25-27页 |
| 1.2.6 CB1活化的生理功能 | 第27-28页 |
| 1.2.6.1 慢性乙型肝炎纤维化 | 第27-28页 |
| 1.2.6.2 肝细胞癌 | 第28页 |
| 1.2.6.3 帕金森 | 第28页 |
| 1.2.7 抑制CB1活化的临床作用 | 第28-29页 |
| 1.2.7.1 治疗肥胖 | 第28-29页 |
| 1.2.7.2 改善糖尿病性血脂异常 | 第29页 |
| 1.3 本研究主要的实验技术-荧光共振能量转移技术 | 第29-34页 |
| 1.3.1 FRET技术的原理 | 第29-30页 |
| 1.3.2 FRET技术的应用 | 第30-34页 |
| 1.3.2.1 检测酶活性变化 | 第31-33页 |
| 1.3.2.3 细胞膜受体之间相互作用 | 第33页 |
| 1.3.2.4 细胞内分子之间相互作用 | 第33-34页 |
| 1.3.3 FRET技术的优缺点 | 第34页 |
| 1.4 本研究的目的和意义 | 第34-37页 |
| 第二章 pcDNA5/FRT/TO-VSV-GluR5-CB1-M-eYFP-Turquoise分子探针生物活性的检测 | 第37-79页 |
| 2.1 实验材料 | 第38页 |
| 2.1.1 载体及菌种 | 第38页 |
| 2.1.2 实验用细胞 | 第38页 |
| 2.1.3 实验仪器和耗材 | 第38页 |
| 2.2 实验方法 | 第38-61页 |
| 2.2.1 构建pcDNA5/FRT/TO-VSV-GluR5-CB1-Turquiose质粒 | 第38-46页 |
| 2.2.1.1 Clontechkit(In-FusionHDCloningKit)试剂盒 | 第39-40页 |
| 2.2.1.2 PCR线性化载体和扩增目的片段 | 第40-42页 |
| 2.2.1.3 琼脂糖凝胶电泳 | 第42-43页 |
| 2.2.1.4 胶回收 | 第43页 |
| 2.2.1.5 clontechkit连接反应 | 第43-44页 |
| 2.2.1.6 转化 | 第44页 |
| 2.2.1.7 LB液体培养基中扩大培养 | 第44页 |
| 2.2.1.8 抽提质粒 | 第44-45页 |
| 2.2.1.9 酶切鉴定 | 第45-46页 |
| 2.2.1.10 测序 | 第46页 |
| 2.2.2 构建CB1-M分子探针质粒 | 第46-48页 |
| 2.2.2.1 PCR线性化载体和扩增目的片段 | 第46-48页 |
| 2.2.2.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第48页 |
| 2.2.2.3 胶回收 | 第48页 |
| 2.2.2.4 clontechkit连接反应 | 第48页 |
| 2.2.2.5 转化 | 第48页 |
| 2.2.2.6 LB液体培养基中扩大培养 | 第48页 |
| 2.2.2.7 抽提质粒 | 第48页 |
| 2.2.2.8 酶切鉴定 | 第48页 |
| 2.2.2.9 测序 | 第48页 |
| 2.2.3 瞬时转染293T细胞 | 第48-51页 |
| 2.2.3.1 多聚赖氨酸包被6孔板 | 第49-50页 |
| 2.2.3.2 铺板 | 第50页 |
| 2.2.3.3 转染 | 第50-51页 |
| 2.2.3.4 观察并拍照 | 第51页 |
| 2.2.4 蛋白免疫印迹(Westernblot) | 第51-54页 |
| 2.2.4.1 蛋白浓度测定 | 第51-52页 |
| 2.2.4.2 蛋白免疫检测 | 第52-54页 |
| 2.2.5 筛选稳定的诱导表达细胞系 | 第54-56页 |
| 2.2.5.1 铺板 | 第54页 |
| 2.2.5.2 转染 | 第54-55页 |
| 2.2.5.3 转染细胞的扩大培养 | 第55页 |
| 2.2.5.4 筛选稳定细胞株 | 第55-56页 |
| 2.2.5.5 稳定株阳性克隆的扩大培养 | 第56页 |
| 2.2.6 荧光共振能量转移技术 | 第56-57页 |
| 2.2.6.1 显微镜成像系统操作指南 | 第56-57页 |
| 2.2.6.2 FRET实验操作 | 第57页 |
| 2.2.7 检测细胞内Ca~(2+)变化的实验方法 | 第57-58页 |
| 2.2.8 生物素标记法检测细胞的内吞 | 第58-59页 |
| 2.2.8.1 生物素标记法的原理 | 第58页 |
| 2.2.8.2 生物素标记法的操作步骤： | 第58-59页 |
| 2.2.9 高速荧光显微镜检测大麻素受体内吞的实验步骤： | 第59页 |
| 2.2.10 构建CB1-M-(C257A/C264A)质粒 | 第59-61页 |
| 2.2.10.1 KOD-Plus-MutagenesisKit试剂盒 | 第59-61页 |
| 2.2.10.2 转化 | 第61页 |
| 2.3 实验结果 | 第61-78页 |
| 2.3.1 CB1-M质粒的构建 | 第61-68页 |
| 2.3.1.1 构建pcDNA5/FRT/TO-VSV-GluR5-CB1-Turquoise载体质粒 | 第61-65页 |
| 2.3.1.2 构建pcDNA5/FRT/TO-VSV-GluR5-CB1-M-eYFP-Turquoise载体质粒 | 第65-68页 |
| 2.3.2 稳定细胞株的筛选 | 第68-69页 |
| 2.3.2.1 质粒瞬时转染293T细胞 | 第68页 |
| 2.3.2.2 稳定的诱导表达细胞系的构建 | 第68-69页 |
| 2.3.3 FRET技术检测分子探针活性 | 第69-72页 |
| 2.3.3.1 WIN-55,212-2(WIN)时间和剂量依赖性的诱导分子探针FRET信号的改变 | 第69-70页 |
| 2.3.3.2 CB1-M受体分子探针激活动力学参数计算 | 第70页 |
| 2.3.3.3 拮抗剂预处理对WIN刺激引发的FRET基线跳动的影响 | 第70-71页 |
| 2.3.3.4 FRET检测不同激动剂引发的FRET信号的变化 | 第71-72页 |
| 2.3.3.5 CB1-M受体分子探针激活动力学参数计算 | 第72页 |
| 2.3.4 细胞内Ca~(2+)浓度的变化 | 第72-74页 |
| 2.3.5 WIN诱导受体分子探针发生内化 | 第74-75页 |
| 2.3.5.1 高速荧光显微镜观察受体分子探针的内化情况 | 第74页 |
| 2.3.5.2 生物素标记法检测受体分子探针的内化情况 | 第74-75页 |
| 2.3.6 Westernbolt检测受体分子探针介导的下游ERK1/2通路的激活情况 | 第75-77页 |
| 2.3.6.1 Western-blot检测下游ERK1/2通路的激活情况 | 第75-76页 |
| 2.3.6.2 Western-blot检测拮抗剂对下游ERK1/2通路激活的影响。 | 第76-77页 |
| 2.3.7 C257A、C264A突变对下游ERK1/2通路激活的影响 | 第77-78页 |
| 2.4 本章小结 | 第78-79页 |
| 第三章 pcDNA5/FRT/TO-VSV-GluR5-CB1-12-eYFP-Turquoise分子探针生物活性的检测 | 第79-91页 |
| 3.1 实验材料 | 第79-80页 |
| 3.1.1 载体及菌种 | 第79页 |
| 3.1.2 实验用细胞 | 第79页 |
| 3.1.3 实验仪器和耗材 | 第79-80页 |
| 3.2 实验内容 | 第80-83页 |
| 3.2.1 构建CB1-12分子探针质粒 | 第80-82页 |
| 3.2.1.1 PCR线性化载体和扩增目的片段 | 第80-82页 |
| 3.2.1.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第82页 |
| 3.2.1.3 胶回收 | 第82页 |
| 3.2.1.4 clontechkit连接反应 | 第82页 |
| 3.2.1.5 转化 | 第82页 |
| 3.2.1.6 LB液体培养基中扩大培养 | 第82页 |
| 3.2.1.7 抽提质粒 | 第82页 |
| 3.2.1.8 酶切鉴定 | 第82页 |
| 3.2.1.9 测序 | 第82页 |
| 3.2.2 瞬时转染293T细胞 | 第82页 |
| 3.2.3 蛋白免疫印迹法 | 第82页 |
| 3.2.4 稳定转染Flipin细胞 | 第82-83页 |
| 3.2.5 FRET技术 | 第83页 |
| 3.3 实验结果 | 第83-89页 |
| 3.3.1 CB1-12分子探针质粒的构建 | 第83-86页 |
| 3.3.1.1 PCR扩增eYFP片段、线性化pcDNA5/FRT/TO-VSV-GluR5-CB1-Turquoise载体 | 第83页 |
| 3.3.1.2 连接产物pcDNA5/FRT/TO-VSV-GluR5-CB1-12-eYFP-Turquoise酶切鉴定 | 第83-84页 |
| 3.3.1.3 序列比对 | 第84-86页 |
| 3.3.2 稳定细胞株的筛选及活性检测 | 第86-87页 |
| 3.3.2.1 质粒瞬时转染293T细胞 | 第86-87页 |
| 3.3.2.2 稳定的诱导表达细胞系的筛选 | 第87页 |
| 3.3.4 WIN刺激诱导FRER信号的变化 | 第87-89页 |
| 3.3.4.1 FRET技术检测WIN刺激引发的FRET信号的变化 | 第87-88页 |
| 3.3.4.2 Western-blot检测分子探针的表达及下游ERK通路的激活情况 | 第88-89页 |
| 3.4 本章小结 | 第89-91页 |
| 第四章 总结 | 第91-93页 |
| 致谢 | 第93-95页 |
| 参考文献 | 第95-104页 |
| 附录A 实验仪器 | 第104-106页 |
| 附录B 实验试剂 | 第106-108页 |
| 附录C 试剂配方 | 第108-111页 |
| 研究生期间发表的学术论文 | 第111-113页 |
| 研究生期间的获奖情况 | 第113页 |
