| 符号说明 | 第4-9页 |
| 中文摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 1 前言 | 第14-21页 |
| 1.1 植物对植原体侵染的响应机制 | 第14-16页 |
| 1.2 植物miRNAs的研究进展 | 第16-19页 |
| 1.3 本研究的目的意义 | 第19-21页 |
| 2 材料与方法 | 第21-43页 |
| 2.1 材料 | 第21-23页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第21页 |
| 2.1.2 菌株与载体 | 第21页 |
| 2.1.3 试剂 | 第21页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第21-22页 |
| 2.1.5 引物 | 第22-23页 |
| 2.2 方法 | 第23-43页 |
| 2.2.1 桑树响应植原体侵染的新miRNAs的鉴定与筛选 | 第23页 |
| 2.2.2 桑树响应新miRNAs的表达差异显著性验证 | 第23-25页 |
| 2.2.2.1 桑树叶片总RNA的提取 | 第23-24页 |
| 2.2.2.2 cDNA的合成 | 第24-25页 |
| 2.2.2.3 荧光定量PCR | 第25页 |
| 2.2.3 新miRNAs基因的克隆 | 第25-28页 |
| 2.2.3.1 DNA的提取 | 第25-26页 |
| 2.2.3.2 PCR扩增 | 第26-27页 |
| 2.2.3.3 目的片段的回收 | 第27页 |
| 2.2.3.4 大肠杆菌感受态的制备 | 第27页 |
| 2.2.3.5 目的片段与克隆载体的连接、转化 | 第27-28页 |
| 2.2.3.6 序列测定 | 第28页 |
| 2.2.3.7 新miRNAs基因序列分析 | 第28页 |
| 2.2.4 新miRNAs植物表达载体的构建 | 第28-30页 |
| 2.2.4.1 质粒的提取 | 第28-29页 |
| 2.2.4.2 质粒的酶切和目的片段回收 | 第29页 |
| 2.2.4.3 pBI121-mul-miRNAs载体构建 | 第29-30页 |
| 2.2.5 新miRNAs转基因拟南芥的获得 | 第30-32页 |
| 2.2.5.1 农杆菌GV3101感受态细胞的转化 | 第30-31页 |
| 2.2.5.2 拟南芥的无土栽培 | 第31页 |
| 2.2.5.3 拟南芥的侵染与筛选鉴定 | 第31-32页 |
| 2.2.6 转基因拟南芥中新miRNAs基因的表达分析 | 第32-38页 |
| 2.2.6.1 Trizol法提取拟南芥总RNA | 第32页 |
| 2.2.6.2 RNA的甲醛变性凝胶电泳 | 第32-33页 |
| 2.2.6.3 转膜 | 第33页 |
| 2.2.6.4 探针制备 | 第33-34页 |
| 2.2.6.5 DIG标记有效性检测 | 第34-36页 |
| 2.2.6.6 Northern杂交 | 第36-37页 |
| 2.2.6.7 地高辛杂交探针的洗脱 | 第37-38页 |
| 2.2.7 新miRNAs成熟体在拟南芥中的表达检测 | 第38-39页 |
| 2.2.7.1 miRNA的反转录 | 第38-39页 |
| 2.2.7.2 miRNAs的荧光定量PCR | 第39页 |
| 2.2.8 新miRNAs的靶基因预测及验证 | 第39页 |
| 2.2.8.1 新miRNAs的靶基因预测 | 第39页 |
| 2.2.8.2 桑树新miRNAs靶基因的验证 | 第39页 |
| 2.2.9 新miRAs靶基因的扩增及其植物表达载体的构建 | 第39-40页 |
| 2.2.10 转桑树miRNAs靶基因拟南芥的获得与鉴定 | 第40页 |
| 2.2.11 桑树miRNAs靶基因在转基因拟南芥中的表达验证 | 第40-41页 |
| 2.2.12 桑树miRNAs及其靶基因的生物学功能分析 | 第41-43页 |
| 2.2.12.1 转基因拟南芥的干旱、盐胁迫处理 | 第41页 |
| 2.2.12.2 Pst DC3000接种拟南芥 | 第41页 |
| 2.2.12.3 胼胝质染色 | 第41页 |
| 2.2.12.4 Pst DC3000的cfu值测定 | 第41-42页 |
| 2.2.12.5 H_2O_2和O_2~-的染色分析 | 第42-43页 |
| 3 结果与分析 | 第43-67页 |
| 3.1 桑树响应植原体侵染的新miRNAs的筛选与表达差异显著性分析 | 第43-45页 |
| 3.1.1 桑树新miRNAs的鉴定与筛选 | 第43-44页 |
| 3.1.2 新miRNAs表达差异显著性分析 | 第44-45页 |
| 3.2 桑树响应植原体侵染的新miRNAs基因克隆及其在转基因拟南芥中的表达分析 | 第45-49页 |
| 3.2.1 桑树新miRNAs基因的克隆与植物表达载体的构建 | 第45-47页 |
| 3.2.1.1 桑树新miRNAs基因的克隆 | 第45-46页 |
| 3.2.1.2 桑树新miRNAs基因植物表达载体的构建 | 第46-47页 |
| 3.2.2 转新miRNAs基因拟南芥的获得与筛选鉴定 | 第47页 |
| 3.2.3 转基因拟南芥中新miRNAs的表达分析 | 第47-49页 |
| 3.2.3.1 转基因拟南芥中新miRNAs前体的Northern blot | 第47-48页 |
| 3.2.3.2 新miRNAs成熟体在拟南芥中的表达检测 | 第48-49页 |
| 3.3 桑树新miRNAs靶基因的克隆及其在转基因拟南芥中的表达分析 | 第49-54页 |
| 3.3.1 桑树新miRNAs靶基因的预测 | 第49-50页 |
| 3.3.2 桑树新miRNAs靶基因的克隆 | 第50-51页 |
| 3.3.3 植原体侵染对桑树新miRNAs靶基因的表达影响分析 | 第51-52页 |
| 3.3.4 转桑树新miRNAs基因的拟南芥中同源靶基因的表达分析 | 第52-53页 |
| 3.3.5 桑树新miRNAs靶基因的植物表达载体构建 | 第53页 |
| 3.3.6 转桑树新miRNAs靶基因拟南芥的筛选鉴定 | 第53-54页 |
| 3.3.7 转基因拟南芥中桑树新miRNAs靶基因的表达分析 | 第54页 |
| 3.4 桑树新miRNAs的生物学功能分析 | 第54-60页 |
| 3.4.1 转桑树新miRNAs基因拟南芥的表型分析 | 第54-55页 |
| 3.4.2 桑树新miRNAs对植物抗盐胁迫能力的影响 | 第55-56页 |
| 3.4.3 桑树新miRNAs对植物抗干旱胁迫能力的影响 | 第56-58页 |
| 3.4.4 桑树新miRNAs影响植物对Pst DC3000的抗性 | 第58-60页 |
| 3.5 桑树新miRNAs靶基因的生物学功能分析 | 第60-67页 |
| 3.5.1 转桑树新miRNAs靶基因拟南芥的表型分析 | 第60-61页 |
| 3.5.2 桑树新miRNAs靶基因影响植物抗盐胁迫能力 | 第61-62页 |
| 3.5.3 桑树新miRNAs靶基因影响植物抗干旱胁迫能力 | 第62-64页 |
| 3.5.4 桑树新miRNAs靶基因影响植物对Pst DC3000的抗性 | 第64-67页 |
| 4 讨论 | 第67-72页 |
| 4.1 桑树和拟南芥中的miRNAs具有相似的合成、加工和作用机制 | 第67-68页 |
| 4.2 响应植原体侵染的miRNAs可以同时参与植物的生长发育和多种胁迫响应过程 | 第68-70页 |
| 4.3 基于miRNA水平上的植物对环境胁迫的响应机制具有复杂多样性 | 第70-72页 |
| 5 结论 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第82页 |
