| 中文摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 引言 | 第14-26页 |
| 1.1 肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica) | 第14-17页 |
| 1.1.1 肠炎沙门氏菌概述 | 第14-15页 |
| 1.1.2 毒力岛、毒力蛋白和Ⅲ型分泌系统(SPIs、Effectors and T3SS) | 第15-17页 |
| 1.1.3 宿主细胞对沙门氏菌感染的抵抗机制 | 第17页 |
| 1.2 蛋白质的泛素化修饰途径(Ubiquitination) | 第17-21页 |
| 1.2.1 蛋白泛素化修饰过程简介 | 第17-20页 |
| 1.2.2 细菌侵染宿主与泛素化修饰过程 | 第20-21页 |
| 1.3 酵母双杂交技术(Yeast Two-Hybrid) | 第21-24页 |
| 1.3.1 酵母双杂交技术的原理 | 第21-23页 |
| 1.3.2 酵母双杂交技术的应用：文库筛选(寻找相互作用蛋白对象) | 第23-24页 |
| 1.4 验证蛋白之间相互作用的常用方法 | 第24-26页 |
| 1.4.1 Pull-down assay | 第24页 |
| 1.4.2 激光共聚焦(Confocal) | 第24页 |
| 1.4.3 免疫共沉淀(Co-Immnoprecipitation,Co-IP) | 第24-25页 |
| 1.4.4 其他：生物传感器、非变性胶、质谱等 | 第25-26页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第26-43页 |
| 2.1 实验通用仪器、设备 | 第26页 |
| 2.2 通用实验试剂 | 第26-27页 |
| 2.3 常规分子克隆实验技术 | 第27-30页 |
| 2.3.1 大肠杆菌化转感受态细胞制备和使用 | 第27-28页 |
| 2.3.2 大肠杆菌电转感受态制备和使用 | 第28页 |
| 2.3.3 大肠杆菌质粒的抽提 | 第28-29页 |
| 2.3.4 PCR和限制性酶切 | 第29页 |
| 2.3.5 定点突变PCR | 第29-30页 |
| 2.4 酵母双杂交系列实验 | 第30-35页 |
| 2.4.1 cDNA文库的滴定和扩增 | 第30-32页 |
| 2.4.2 酵母双杂交所用培养基 | 第32页 |
| 2.4.3 酵母感受态的制备以酵母转化 | 第32-33页 |
| 2.4.4 抽提酵母质粒 | 第33页 |
| 2.4.5 X-gal显色实验 | 第33-34页 |
| 2.4.6 酵母双杂交筛选文库 | 第34-35页 |
| 2.5 细胞水平实验 | 第35-37页 |
| 2.5.1 细胞培养基及试剂 | 第35-36页 |
| 2.5.2 细胞培养(以293T细胞为例) | 第36页 |
| 2.5.3 磷酸钙法转染细胞(以转染6cm培养皿293T细胞为例) | 第36-37页 |
| 2.5.4 脂质体法转染细胞(以NEO fectine转染6cm皿293T细胞为例) | 第37页 |
| 2.6 体外蛋白质学实验 | 第37-43页 |
| 2.6.1 PAGE电泳和Western Blot检测 | 第37-40页 |
| 2.6.2 蛋白的原核表达及纯化 | 第40-41页 |
| 2.6.3 免疫共沉淀实验 | 第41页 |
| 2.6.4 GST pull-down实验 | 第41页 |
| 2.6.5 体内及体外泛索化修饰检测实验 | 第41-43页 |
| 第三章 系统筛选与肠炎沙门氏菌T3SS毒力岛1、毒力岛2分泌蛋白相互作用的宿主蛋白 | 第43-80页 |
| 3.1 综述 | 第43-44页 |
| 3.2 实验过程和结果 | 第44-73页 |
| 3.2.1 酵母双杂交以及真核表达诱饵(Bait)质粒的构建 | 第44-45页 |
| 3.2.2 Bait质粒的酵母转化、鉴定及自激活实验 | 第45页 |
| 3.2.3 cDNA文库的扩增及滴度测定 | 第45-46页 |
| 3.2.4 文库筛选及阳性克隆的X-gal显色实验 | 第46-47页 |
| 3.2.5 阳性克隆中酵母质粒的提取和分离 | 第47-48页 |
| 3.2.6 阳性结果的酵母回交实验 | 第48页 |
| 3.2.7 数据整理分析 | 第48-72页 |
| 3.2.8 部分结果的免疫共沉淀验证 | 第72-73页 |
| 3.3 分析与讨论 | 第73-80页 |
| 第四章 肠炎沙门氏菌T3SS毒力蛋白SSPH2特异性结合并泛素化修饰宿主蛋白LOM4 | 第80-112页 |
| 4.1 综述 | 第80-85页 |
| 4.1.1 肠炎沙门氏菌T3SS毒力蛋白SsPH2 | 第80-81页 |
| 4.1.2 沙门氏菌毒力蛋白与泛素化修饰 | 第81-82页 |
| 4.1.3 LMO4蛋白(LIM domain only4) | 第82-83页 |
| 4.1.4 实验概述 | 第83-85页 |
| 4.2 实验过程与结果 | 第85-107页 |
| 4.2.1 所用质粒的构建 | 第85-88页 |
| 4.2.2 酵母双杂交验证相互作用 | 第88-89页 |
| 4.2.3 免疫共沉淀验证LMO4与SsPH2的体内相互作用 | 第89-90页 |
| 4.2.4 GST-pull down | 第90-92页 |
| 4.2.5 SsPH2与LMO4结合域的确定 | 第92-95页 |
| 4.2.6 SsPH2泛素连接酶活性的体外检测 | 第95-96页 |
| 4.2.7 SsPH2于体内和体外均可催化LMO4的泛素化修饰 | 第96-100页 |
| 4.2.8 SsPH2催化LMO4泛素化修饰既不是泛素分子K48也不是K63依赖的 | 第100-102页 |
| 4.2.9 SsPH2催化LMO4第29位和67位赖氨酸残基(K29,K67)泛素化修饰 | 第102-103页 |
| 4.2.10 哺乳动物细胞中SsPH2的表达上调LMO4的蛋白水平 | 第103-105页 |
| 4.2.11 SsPH2对LMO4蛋白水平的上调是通过延长LMO4蛋白的半衰期实现的,并且这种作用依赖于SsPH2对LMO4的泛素化修饰 | 第105-107页 |
| 4.3 分析与讨论 | 第107-112页 |
| 参考文献 | 第112-120页 |
| 攻博期间已发表或正在撰写的论文 | 第120-121页 |
| 致谢 | 第121-122页 |
| 附录 | 第122-123页 |
