| 摘要 | 第4-8页 |
| ABSTRACT | 第8-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-50页 |
| 1.1 RNAI技术的机制与应用 | 第18-23页 |
| 1.1.1 RNA干扰现象发现 | 第18-20页 |
| 1.1.2 RNAi技术的基本分子机制 | 第20-22页 |
| 1.1.3 RNAi应用 | 第22-23页 |
| 1.2 RNA聚合酶Ⅲ启动子的结构和应用 | 第23-27页 |
| 1.2.1 RNA聚合酶Ⅲ启动子的起源 | 第23-24页 |
| 1.2.2 RNA聚合酶Ⅲ启动子的结构 | 第24-25页 |
| 1.2.3 RNA聚合酶Ⅲ启动子的可修饰性 | 第25-26页 |
| 1.2.4 各物种RNA聚合酶Ⅲ启动子的克隆与鉴定 | 第26-27页 |
| 1.3 RNAI技术抗病毒原理和应用 | 第27-29页 |
| 1.3.1 RNAi技术抗病毒基本原理 | 第27页 |
| 1.3.2 RNAi技术抗病毒应用 | 第27-29页 |
| 1.4 口蹄疫的概述 | 第29-39页 |
| 1.4.1 口蹄疫的发生和危害 | 第29-30页 |
| 1.4.2 流行病学特点及临床诊断 | 第30-32页 |
| 1.4.3 防治手段 | 第32-34页 |
| 1.4.4 口蹄疫病毒基本结构 | 第34-37页 |
| 1.4.5 口蹄疫病毒的致病机制 | 第37-39页 |
| 1.5 动物转基因技术的研究进展和意义 | 第39-47页 |
| 1.5.1 动物转基因技术的发展和应用 | 第39-45页 |
| 1.5.2 动物转基因技术的应用 | 第45-47页 |
| 1.6 研究目的及意义 | 第47-50页 |
| 第二章 水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子的克隆及鉴定 | 第50-74页 |
| 摘要 | 第50-51页 |
| 前言 | 第51页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第51-52页 |
| 2.2 主要试验仪器 | 第52-53页 |
| 2.3 试验方法 | 第53-59页 |
| 2.3.1 全基因组DNA的抽提 | 第53页 |
| 2.3.2 水牛启动子扩增及测序 | 第53-54页 |
| 2.3.3 降落PCR | 第54-55页 |
| 2.3.4 RNAi表达载体的构建 | 第55页 |
| 2.3.5 细胞培养及转染 | 第55-56页 |
| 2.3.6 总RNA的抽提 | 第56页 |
| 2.3.7 shEGFP表达量的茎-环RT-PCR对分析 | 第56-57页 |
| 2.3.8 细胞表达EGFP的流式细胞仪的分析 | 第57页 |
| 2.3.9 细胞表达EGFP的荧光实时定量PCR分析 | 第57-59页 |
| 2.4 结果 | 第59-71页 |
| 2.4.1 水牛7SK、U6启动子的克隆 | 第59-63页 |
| 2.4.2 7SK和U6启动子表达shRNA载体的构建 | 第63-64页 |
| 2.4.3 shEGFP表达量的实时定量PCR检测 | 第64-66页 |
| 2.4.4 启动子在细胞中引导表达shRNA的效果 | 第66-69页 |
| 2.4.5 EGFP表达的荧光实时定量PCR结果 | 第69-71页 |
| 2.5 讨论 | 第71-73页 |
| 2.6 结论 | 第73-74页 |
| 第三章 多SHRNA串联表达抗口蹄疫转基因载体构建与功能性检测 | 第74-94页 |
| 摘要 | 第74-75页 |
| 前言 | 第75-76页 |
| 3.1 材料与试剂 | 第76页 |
| 3.2 主要试验仪器 | 第76-77页 |
| 3.3 试验方法 | 第77-82页 |
| 3.3.1 抗口蹄疫shRNA选择和合成 | 第77页 |
| 3.3.2 多shRNA串联抗口蹄疫表达载体的构建 | 第77-78页 |
| 3.3.3 多个shRNA串联抗口蹄疫表达载体的慢病毒包装 | 第78-79页 |
| 3.3.4 慢病毒载体的滴度测定 | 第79页 |
| 3.3.5 转基因BHK-LV细胞制备 | 第79-80页 |
| 3.3.6 shRNA表达量的实时定量PCR测定 | 第80页 |
| 3.3.7 FMDV在转基因细胞BHK-LV中的复制曲线绘制 | 第80-81页 |
| 3.3.8 抗口蹄疫慢病毒载体的乳鼠FMDV抗性试验 | 第81-82页 |
| 3.4 结果 | 第82-91页 |
| 3.4.1 选择和设计的抗口蹄疫shRNA序列 | 第82页 |
| 3.4.2 构建得到的多个shRNA串联抗口蹄疫慢病毒表达载体和制备的转基因细胞 | 第82-88页 |
| 3.4.3 FMDV在转基因细胞内的复制情况 | 第88-90页 |
| 3.4.4 慢病毒LV-3shRNA处理乳鼠的抗FMDV能力 | 第90-91页 |
| 3.5 讨论 | 第91-93页 |
| 3.6 结论 | 第93-94页 |
| 第四章 抗口蹄疫RNAI转基因小鼠模型构建和抗病毒水平检测 | 第94-114页 |
| 摘要 | 第94-95页 |
| 前言 | 第95页 |
| 4.1 材料与试剂 | 第95-96页 |
| 4.2 主要试验仪器 | 第96页 |
| 4.3 试验方法 | 第96-102页 |
| 4.3.1 转基因用目的DNA制备 | 第96-97页 |
| 4.3.2 转基因小鼠制备 | 第97-98页 |
| 4.3.3 鼠尾基因组DNA提取 | 第98页 |
| 4.3.4 PCR检测目的片段整合 | 第98-99页 |
| 4.3.5 转基因小鼠选择、传代、遗传稳定性及健康状况鉴定 | 第99页 |
| 4.3.6 转基因小鼠Southern Blotting检测 | 第99-100页 |
| 4.3.7 激光共聚焦显微镜观察转基因小鼠各组织荧光表达 | 第100页 |
| 4.3.8 茎-环RT-PCR法检测转基因小鼠中shRNA表达 | 第100-101页 |
| 4.3.9 FMDV在抗口蹄疫转基因小鼠体内的接毒试验 | 第101-102页 |
| 4.3.10 接种72h后各组织病毒量测定 | 第102页 |
| 4.4 结果 | 第102-110页 |
| 4.4.1 载体目的片段DNA的序列准备 | 第102-103页 |
| 4.4.2 通过显微注射制备得到的转基因小鼠 | 第103页 |
| 4.4.3 F0代转基因小鼠的外源基因整合情况 | 第103-104页 |
| 4.4.4 转基因小鼠的遗传稳定性 | 第104-105页 |
| 4.4.5 转基因小鼠的southern blotting检测结果 | 第105-106页 |
| 4.4.6 激光共聚焦显微镜下转基因小鼠各组织EGFP表达情况 | 第106-107页 |
| 4.4.7 抗口蹄疫shRNA在转基因小鼠组织内的表达 | 第107页 |
| 4.4.8 FMDV在抗口蹄疫转基因小鼠体内的抑制情况 | 第107-109页 |
| 4.4.9 接种后72h各组织病毒抑制情况 | 第109-110页 |
| 4.5 讨论 | 第110-113页 |
| 4.6 结论 | 第113-114页 |
| 第五章 结论 | 第114-115页 |
| 参考文献 | 第115-125页 |
| 附录 | 第125-134页 |
| 致谢 | 第134-135页 |
| 攻读学位期间发表论文及专利情况 | 第135页 |
