| 摘要 | 第2-5页 |
| Abstract | 第5-8页 |
| 符号说明 | 第9-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-27页 |
| 1 奶牛瘤胃上皮细胞体外培养研究进展 | 第16-19页 |
| 1.1 瘤胃上皮的生理功能 | 第16-18页 |
| 1.1.1 短链脂肪酸的吸收 | 第16-17页 |
| 1.1.2 参与钠、氢离子交换和维持瘤胃内环境的平衡 | 第17-18页 |
| 1.2 瘤胃上皮的体外培养 | 第18-19页 |
| 2 细胞永生化研究进展 | 第19-22页 |
| 2.1 细胞永生化机制 | 第19-20页 |
| 2.2 hTERT细胞永生化 | 第20-21页 |
| 2.3 人乳头瘤状病毒16型E6E7基因细胞永生化 | 第21-22页 |
| 2.4 SV40T细胞永生化 | 第22页 |
| 3 GPR41研究进展 | 第22-25页 |
| 3.1 GPR41与炎症的关系 | 第22-23页 |
| 3.2 GPR41与钙离子信号通路和交感神经系统的关系 | 第23-25页 |
| 4 研究目的和内容 | 第25-27页 |
| 4.1 研究目的与意义 | 第25页 |
| 4.2 研究内容 | 第25-26页 |
| 4.3 技术路线 | 第26-27页 |
| 第二章 试验部分 | 第27-91页 |
| 试验一 永生化奶牛瘤胃上皮细胞系的建立 | 第27-44页 |
| 1 材料与方法 | 第27-34页 |
| 1.1 主要仪器 | 第27页 |
| 1.2 试验材料 | 第27-28页 |
| 1.2.1 试剂配制 | 第28页 |
| 1.3 试验方法 | 第28-34页 |
| 1.3.1 奶牛瘤胃上皮细胞原代培养 | 第29页 |
| 1.3.2 奶牛瘤胃上皮细胞的永生化和克隆 | 第29页 |
| 1.3.3 奶牛瘤胃上皮细胞角蛋白18的鉴定 | 第29-30页 |
| 1.3.4 奶牛瘤胃上皮细胞增殖分析 | 第30页 |
| 1.3.5 奶牛瘤胃上皮细胞核型分析 | 第30页 |
| 1.3.6 奶牛瘤胃上皮细胞衰老β-半乳糖苷酶染色分析 | 第30页 |
| 1.3.7 奶牛瘤胃上皮细胞吸收SCFAs分析 | 第30-31页 |
| 1.3.8 RT-PCR检测涉及SCFAs的转运蛋白和受体蛋白 | 第31-32页 |
| 1.3.9 Western Blotting | 第32-34页 |
| 1.4 数据处理与分析 | 第34页 |
| 2 结果与分析 | 第34-41页 |
| 2.1 奶牛瘤胃上皮细胞的建立与特征 | 第34-36页 |
| 2.2 奶牛瘤胃上皮细胞角蛋白18的鉴定 | 第36-37页 |
| 2.3 奶牛瘤胃上皮细胞SCFAs相关转运蛋白和受体蛋白的鉴定 | 第37-38页 |
| 2.4 奶牛瘤胃上皮细胞对SCFAs吸收鉴定 | 第38-39页 |
| 2.5 奶牛瘤胃上皮细胞生长曲线分析 | 第39-40页 |
| 2.6 奶牛瘤胃上皮细胞β-半乳糖苷酶染色分析 | 第40页 |
| 2.7 奶牛乳腺上皮细胞核型分析 | 第40-41页 |
| 3 讨论 | 第41-43页 |
| 4 小结 | 第43-44页 |
| 试验二 SCFAs对相关短链脂肪酸转运蛋白和GPR41表达影响 | 第44-51页 |
| 1 材料与方法 | 第44-45页 |
| 1.1 主要仪器 | 第44页 |
| 1.2 试验材料 | 第44页 |
| 1.3 试验方法 | 第44-45页 |
| 1.3.1 SCFAs和不同pH对涉及SCFAs转运蛋白和GPR41表达影响 | 第44页 |
| 1.3.2 总RNA提取 | 第44页 |
| 1.3.3 反转录成cDNA | 第44-45页 |
| 1.3.4 Real-time PCR | 第45页 |
| 1.4 数据统计分析 | 第45页 |
| 2 结果与分析 | 第45-48页 |
| 2.1 SCFAs和不同pH对单羧酸转运蛋白MCT1和MCT4表达的影响 | 第46页 |
| 2.2 SCFAs和不同pH对NHE1、NHE2和NHE3表达影响 | 第46-47页 |
| 2.3 SCFAs和不同pH对GPR41表达的影响 | 第47-48页 |
| 3 讨论 | 第48-49页 |
| 4 小结 | 第49-51页 |
| 试验三 转录组分析SCFAs诱导BRECs的mRNA差异基因和差异信号通路 | 第51-60页 |
| 1 材料与方法 | 第51-53页 |
| 1.1 主要仪器 | 第51页 |
| 1.2 试验材料 | 第51页 |
| 1.3 试验设计 | 第51页 |
| 1.4 试验方法 | 第51-53页 |
| 1.4.1 总RNA提取 | 第52页 |
| 1.4.2 文库构建和测序 | 第52-53页 |
| 1.5 数据处理与分析 | 第53页 |
| 2 结果与分析 | 第53-59页 |
| 2.1 RNA-Seq的PCA得分图 | 第53-54页 |
| 2.2 mRNA差异基因表达分析 | 第54-56页 |
| 2.3 KEGG信号通路分析 | 第56-59页 |
| 3 讨论 | 第59页 |
| 4 小结 | 第59-60页 |
| 试验四 SCFAs对BRECs的促炎症因子、趋化因子和紧密连接蛋白表达的影响 | 第60-74页 |
| 1 材料与方法 | 第60-63页 |
| 1.1 主要仪器 | 第60页 |
| 1.2 试验材料 | 第60页 |
| 1.3 试验方法 | 第60-62页 |
| 1.3.1 qRT-PCR验证转录组 | 第60页 |
| 1.3.2 不同浓度SCFAs对炎症因子、趋化因子和紧密连接蛋白表达的影响 | 第60-61页 |
| 1.3.3 不同时间点对炎症因子、趋化因子和紧密连接蛋白表达的影响 | 第61页 |
| 1.3.4 总RNA提取 | 第61页 |
| 1.3.5 反转录成cDNA | 第61页 |
| 1.3.6 Real-time PCR | 第61-62页 |
| 1.3.7 Western bloiting | 第62页 |
| 1.4 数据统计分析 | 第62-63页 |
| 2 结果与分析 | 第63-70页 |
| 2.1 SCFAs对BRECs的促炎症因子表达的影响 | 第63页 |
| 2.2 SCFAs对BRECs的趋化因子表达的影响 | 第63-65页 |
| 2.3 SCFAs对涉及Ca~(2+)信号通路中PLC β 2和IP3R1表达的影响 | 第65页 |
| 2.4 SCFAs对MAPK和NF-κ B信号分子表达的影响 | 第65-66页 |
| 2.5 不同浓度SCFAs对炎症因子、趋化因子和紧密连接蛋白表达的影响 | 第66-68页 |
| 2.6 不同时间点对炎症因子、趋化因子和紧密连接蛋白表达的影响 | 第68-70页 |
| 3 讨论 | 第70-72页 |
| 4 小结 | 第72-74页 |
| 试验五 GPR41调控BRECs炎症因子、趋化因子和紧密连接蛋白的表达 | 第74-91页 |
| 1 材料与方法 | 第74-79页 |
| 1.1 主要仪器 | 第74页 |
| 1.2 试验材料 | 第74页 |
| 1.3 试验方法 | 第74-79页 |
| 1.3.1 BRECs细胞电转条件摸索 | 第74-75页 |
| 1.3.2 靶位点设计及合成 | 第75页 |
| 1.3.3 gRNA引物添加接头 | 第75页 |
| 1.3.4 敲除载体的构建 | 第75-76页 |
| 1.3.5 转化Top 10感受态 | 第76-77页 |
| 1.3.6 筛选阳性重组子 | 第77页 |
| 1.3.7 电转敲除载体至BRECs | 第77页 |
| 1.3.8 细胞测序验证GPR41敲除效率 | 第77页 |
| 1.3.9 BRECs单克隆的制备和生长 | 第77页 |
| 1.3.10 单克隆基因组DNA的提取 | 第77-78页 |
| 1.3.11 PCR扩增目的片段和Cruiser Enzyme酶切筛选阳性克隆 | 第78-79页 |
| 1.3.12 TA克隆 | 第79页 |
| 1.3.13 Real-time PCR | 第79页 |
| 1.4 数据统计分析 | 第79页 |
| 2 结果与分析 | 第79-88页 |
| 2.1 不同电压对BRECs电转效率的影响 | 第80页 |
| 2.2 敲除载体的构建 | 第80-81页 |
| 2.3 单克隆BRECs的Cruiser Enzyme酶切筛选阳性克隆及测序 | 第81-82页 |
| 2.4 单克隆BRECs的TA克隆及测序 | 第82-83页 |
| 2.5 qRT-PCR验证CRISPR/Cas 9敲除GPR41的表达 | 第83-84页 |
| 2.6 GPR41对促炎症因子表达的影响 | 第84-85页 |
| 2.7 GPR41对趋化因子表达的影响 | 第85-86页 |
| 2.8 GPR41对紧密连接蛋白表达的影响 | 第86-87页 |
| 2.9 GPR41对Ca~(2+)信号通路关键分子表达的影响 | 第87-88页 |
| 3 讨论 | 第88-90页 |
| 4 小结 | 第90-91页 |
| 第三章 全文总结 | 第91-92页 |
| 1 全文结论 | 第91页 |
| 2 创新点 | 第91页 |
| 3 进一步研究的问题 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-104页 |
| 致谢 | 第104-105页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第105-106页 |
| 科研成果 | 第106-107页 |
