| 中文摘要 | 第4-7页 |
| Abstract | 第7-10页 |
| 目录 | 第11-14页 |
| 英文缩略词表 | 第14-16页 |
| 前言 | 第16-21页 |
| 第一章 人核糖体基因区打靶载体携带FⅧ打靶hESCs | 第21-63页 |
| 1.1 材料 | 第22-28页 |
| 1.1.1 菌株、细胞系及实验动物 | 第22页 |
| 1.1.2 质粒载体 | 第22页 |
| 1.1.3 限制性核酸内切酶与聚合酶 | 第22页 |
| 1.1.4 试剂盒 | 第22页 |
| 1.1.5 仪器设备 | 第22-23页 |
| 1.1.6 实验试剂、耗材 | 第23-24页 |
| 1.1.7 引物 | 第24-25页 |
| 1.1.8 主要试剂配制 | 第25-28页 |
| 1.2 方法 | 第28-49页 |
| 1.2.1 技术路线 | 第28页 |
| 1.2.2 质粒的制备 | 第28-31页 |
| 1.2.3 胚胎干细胞的培养 | 第31-33页 |
| 1.2.4 转染胚胎干细胞 | 第33-34页 |
| 1.2.5 基因打靶及定点整合鉴定 | 第34-42页 |
| 1.2.6 定点整合克隆hESCs特性检测 | 第42-45页 |
| 1.2.7 在定点整合hESCs中检测FⅧ的表达 | 第45-49页 |
| 1.3 结果 | 第49-60页 |
| 1.3.1 hESCs细胞培养 | 第49页 |
| 1.3.2 酶切鉴定及线性化pHmFⅧ质粒 | 第49-50页 |
| 1.3.3 转染并筛选抗性hESCs细胞克隆 | 第50页 |
| 1.3.4 鉴定定点整合hESCs | 第50-52页 |
| 1.3.5 定点整合FⅧ的hESCs核型保持正常 | 第52-53页 |
| 1.3.6 定点整合FⅧ的hESCs表达多潜能性标志物 | 第53-55页 |
| 1.3.7 定点整合FⅧ的hESCs定向心肌分化 | 第55-56页 |
| 1.3.8 定点整合FⅧ的hESCs体外具有三胚层分化能力 | 第56页 |
| 1.3.9 定点整合FⅧ的hESCs体内形成畸胎瘤 | 第56-58页 |
| 1.3.10 RT-PCR检测到定点整合FⅧ的hESCs外源FⅧ转录 | 第58页 |
| 1.3.11 ELISA检测定点整合FⅧ的hESCs中FⅧ蛋白表达量 | 第58-60页 |
| 1.4 讨论 | 第60-62页 |
| 1.5 结论 | 第62-63页 |
| 第二章 定点整合FⅧ的hESCs定向肝细胞分化 | 第63-81页 |
| 2.1 材料 | 第64-66页 |
| 2.1.1 实验仪器 | 第64页 |
| 2.1.2 实验试剂、耗材 | 第64-65页 |
| 2.1.3 引物序列 | 第65页 |
| 2.1.4 主要试剂配制 | 第65-66页 |
| 2.2 方法 | 第66-74页 |
| 2.2.1 技术路线 | 第66页 |
| 2.2.2 ET5定向肝细胞分化(ET5-Hep) | 第66-67页 |
| 2.2.3 RT-PCR鉴定ET5-Hep的特异性标志基因 | 第67-68页 |
| 2.2.4 Western blot鉴定ET5-Hep特异性标志基因 | 第68-72页 |
| 2.2.5 免疫荧光检测ET5-Hep肝细胞特异性标志基因 | 第72页 |
| 2.2.6 吲哚花青绿(Indocyanine Green,ICG)摄取与排泌实验 | 第72页 |
| 2.2.7 糖原染色实验 | 第72-73页 |
| 2.2.8 RT-PCR检测ET5-Hep中FⅧ的转录 | 第73页 |
| 2.2.9 ELISA检测ET5-Hep中FⅧ蛋白分泌 | 第73页 |
| 2.2.10 ET5-Hep核型检测 | 第73-74页 |
| 2.3 结果 | 第74-79页 |
| 2.3.1 ET5向肝细胞分化过程中的细胞形态学变化 | 第74页 |
| 2.3.2 ET5-Hep中转录肝细胞标志基因 | 第74-75页 |
| 2.3.3 ET5-Hep中表达肝细胞标志蛋白 | 第75页 |
| 2.3.4 ET5-Hep中可定位肝细胞标志蛋白 | 第75-76页 |
| 2.3.5 ET5-Hep具有ICG摄取及排泌能力 | 第76-77页 |
| 2.3.6 ET5-Hep具备贮存糖原的能力 | 第77页 |
| 2.3.7 ET5-Hep转录外源FⅥⅢ | 第77-78页 |
| 2.3.8 ET5-Hep分泌外源FⅥⅢ蛋白 | 第78页 |
| 2.3.9 ET5-Hep核型检测结果 | 第78-79页 |
| 2.4 讨论 | 第79-80页 |
| 2.5 结论 | 第80-81页 |
| 第三章 定点整合FⅧ的hESCs定向间充质干细胞分化 | 第81-96页 |
| 3.1 材料 | 第82-84页 |
| 3.1.1 实验仪器 | 第82页 |
| 3.1.2 实验试剂、耗材 | 第82页 |
| 3.1.3 主要试剂配制 | 第82-84页 |
| 3.2 方法 | 第84-89页 |
| 3.2.1 技术路线 | 第84页 |
| 3.2.2 ET5定向间充质干细胞分化(ET5-MSCs) | 第84-85页 |
| 3.2.3 流式细胞仪分析ET5-MSCs细胞表面标志物 | 第85-86页 |
| 3.2.4 ET5-MSCs体外向成骨,成脂和软骨细胞的分化 | 第86-87页 |
| 3.2.5 RT-PCR检测ET5-MSCs中FⅧ的转录 | 第87页 |
| 3.2.6 ELISA检测ET5-MSCs中FⅧ蛋白分泌 | 第87页 |
| 3.2.7 ET5-MSCs核型检测 | 第87-88页 |
| 3.2.8 检测ET5-MSCs细胞是否致瘤 | 第88-89页 |
| 3.3 结果 | 第89-94页 |
| 3.3.1 ET5向MSCs分化过程中的细胞形态学变化 | 第89页 |
| 3.3.2 ET5-MSCs冻存复苏后能保持连续传代 | 第89-90页 |
| 3.3.3 流式分析检测到ET5-MSCs表面标志物表达与BM-MSCs一致 | 第90-91页 |
| 3.3.4 ET5-MSCs的多潜能性：向成骨,成脂和软骨细胞的分化 | 第91页 |
| 3.3.5 ET5-MSCs转录外源FⅧ | 第91-92页 |
| 3.3.6 ET5-MSCs不能分泌外源FⅥⅢ蛋白 | 第92页 |
| 3.3.7 ET5-MSCs细胞核型保持正常 | 第92-93页 |
| 3.3.8 ET5-MSCs体内不具有致瘤性 | 第93-94页 |
| 3.4 讨论 | 第94-95页 |
| 3.5 结论 | 第95-96页 |
| 参考文献 | 第96-103页 |
| 综述 | 第103-129页 |
| 参考文献 | 第115-129页 |
| 个人简介 | 第129-131页 |
| 致谢 | 第131-132页 |
