| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-32页 |
| 1.1 丙烯酸简介 | 第13-17页 |
| 1.1.1 丙烯酸的理化性质 | 第13页 |
| 1.1.2 丙烯酸的用途 | 第13页 |
| 1.1.3 丙烯酸的市场情况 | 第13-14页 |
| 1.1.4 丙烯酸的生产方法 | 第14-17页 |
| 1.1.4.1 丙烯氧化法 | 第14-15页 |
| 1.1.4.2 乙炔羰基化路线(REPPE法) | 第15-16页 |
| 1.1.4.3 丙烯腈水解法 | 第16页 |
| 1.1.4.4 乙烯氧化羰基化合成法 | 第16页 |
| 1.1.4.5 氰乙醇法 | 第16-17页 |
| 1.1.4.6 乙烯酮法 | 第17页 |
| 1.2 微生物生产丙烯酸的研究进展 | 第17-25页 |
| 1.2.1 可产生丙烯酸的微生物 | 第17页 |
| 1.2.2 粪产碱杆菌中生产丙烯酸的代谢途径 | 第17-18页 |
| 1.2.3 红球菌中生产丙烯酸的代谢途径 | 第18-19页 |
| 1.2.4 丙酸梭菌中生产丙烯酸的代谢途径 | 第19-25页 |
| 1.3 基因文库技术分离目的基因 | 第25-31页 |
| 1.3.1 基因文库的类别 | 第26-27页 |
| 1.3.2 核基因组文库构建核基因组文库构建 | 第27-28页 |
| 1.3.3 利用PCR技术构建cDNA文库 | 第28页 |
| 1.3.4 应用差别杂交或扣除杂交法构建cDNA文库 | 第28-29页 |
| 1.3.5 人工染色体文库 | 第29-31页 |
| 1.4 存在的问题及展望 | 第31页 |
| 1.5 实验目的 | 第31-32页 |
| 第二章 粪产碱杆菌基因文库的构建及二甲基巯基丙酸裂解酶(DMSPLYASE)的筛选 | 第32-42页 |
| 2.1 引言 | 第32-33页 |
| 2.2 材料和方法 | 第33-34页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第33页 |
| 2.2.2 培养基 | 第33页 |
| 2.2.3 试剂和仪器 | 第33-34页 |
| 2.3 实验方法 | 第34-36页 |
| 2.3.1 培养方法 | 第34页 |
| 2.3.2 ALCALIGENESFAECALIS基因组DNA的提取 | 第34-35页 |
| 2.3.3 DNASE Ⅰ酶切粪产碱杆菌基因组DNA | 第35页 |
| 2.3.4 PET-22B质粒的提取 | 第35页 |
| 2.3.5 PET-22B质粒的酶切 | 第35-36页 |
| 2.3.6 PET-22B质粒5’的去磷酸化 | 第36页 |
| 2.3.7 粪产碱杆菌DNA文库的构建 | 第36页 |
| 2.3.8 阳性克隆的筛选 | 第36页 |
| 2.4 结果和讨论 | 第36-40页 |
| 2.4.1 粪产碱杆菌全基因组电泳 | 第36-37页 |
| 2.4.2 DNASE Ⅰ酶切条件的确定 | 第37-38页 |
| 2.4.3 PET-22B的酶切 | 第38-39页 |
| 2.4.4 粪产碱杆菌基因组DNA文库的构建 | 第39页 |
| 2.4.5 粪产碱杆菌DNA文库的筛选 | 第39-40页 |
| 2.5 小结 | 第40-42页 |
| 第三章 红球菌酰胺酶基因在大肠杆菌的克隆和表达 | 第42-62页 |
| 3.1 引言 | 第42页 |
| 3.2 实验材料 | 第42-43页 |
| 3.2.1 菌株、质粒和引物 | 第42-43页 |
| 3.2.2 培养基 | 第43页 |
| 3.2.3 试剂和仪器 | 第43页 |
| 3.3 实验方法 | 第43-54页 |
| 3.3.1 培养方法 | 第43-44页 |
| 3.3.2 R.ERYTHROPOLI基因组DNA的提取 | 第44-45页 |
| 3.3.3 聚合酶链式反应扩增基因AMI | 第45页 |
| 3.3.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定和分离基因AMI | 第45-46页 |
| 3.3.5 质粒PMD 18-T-AMI的构建 | 第46-47页 |
| 3.3.6 质粒PMD 18-T-AMI转化大肠杆菌 | 第47-48页 |
| 3.3.6.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第47-48页 |
| 3.3.6.2 连接产物的乙醇沉淀 | 第48页 |
| 3.3.6.3 重组质粒电击转化大肠杆菌 | 第48页 |
| 3.3.7 质粒PMD 18-T-AMI的鉴定 | 第48-50页 |
| 3.3.7.1 蓝白斑筛选阳性重组子 | 第48-49页 |
| 3.3.7.2 质粒的酶切鉴定 | 第49页 |
| 3.3.7.3 序列测定和分析 | 第49-50页 |
| 3.3.8 质粒PET-22B的酶切及去磷酸化 | 第50页 |
| 3.3.9 质粒PET-22B-AMI的构建 | 第50-51页 |
| 3.3.10 质粒PET-22B-AMI的鉴定 | 第51-52页 |
| 3.3.10.1 菌落PCR筛选阳性重组子 | 第51页 |
| 3.3.10.2 酶切鉴定 | 第51-52页 |
| 3.3.10.3 序列测定和分析 | 第52页 |
| 3.3.11 AMI基因在大肠杆菌的表达 | 第52-54页 |
| 3.3.11.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定重组蛋白 | 第52-53页 |
| 3.3.11.2 诱导时间的选择 | 第53页 |
| 3.3.11.3 酰胺酶蛋白表达部位 | 第53-54页 |
| 3.3.11.4 诱导温度对酰胺酶活性的影响 | 第54页 |
| 3.3.12 酰胺酶最适酶活测定 | 第54页 |
| 3.3.13 酰胺酶表达量及比酶活的测定 | 第54页 |
| 3.4 结果和讨论 | 第54-60页 |
| 3.4.1 R.ERYTHROPOLI基因组DNA的提取 | 第54-55页 |
| 3.4.2 聚合酶链式反应扩增基因AMI | 第55-56页 |
| 3.4.3 质粒PMD 18-T-AMI的鉴定 | 第56页 |
| 3,4.3.1 双酶切鉴定 | 第56页 |
| 3.4.3.2 序列测定和分析 | 第56页 |
| 3.4.4 质粒 pET-22b~anti 的鉴定 | 第56-57页 |
| 3.4.4.1 菌落PCR | 第56-57页 |
| 3.4.4.2 双酶切鉴定 | 第57页 |
| 3.4.4.3 序列测定和分析 | 第57页 |
| 3.4.5 基因AMI在大肠杆菌的表达 | 第57-58页 |
| 3.4.5.1 诱导时间的选择 | 第57-58页 |
| 3.4.6 重组大肠杆菌中酰胺酶酶活的测定 | 第58-59页 |
| 3.4.7 大肠杆菌中表达的酰胺酶比活和表达量的测定 | 第59-60页 |
| 3.5 小结 | 第60-62页 |
| 第四章 红球菌酰胺酶基因在枯草芽孢杆菌的克隆和表达 | 第62-80页 |
| 4.1 前言 | 第62-63页 |
| 4.2 材料和方法 | 第63-64页 |
| 4.2.1 菌种与质粒 | 第63页 |
| 4.2.2 试验试剂及仪器设备 | 第63页 |
| 4.2.3 培养基和溶液 | 第63-64页 |
| 4.3 试验方法 | 第64-72页 |
| 4.3.1 枯草芽孢杆菌基因组的提取 | 第64-65页 |
| 4.3.2 AMYE启动子信号肽的克隆 | 第65-66页 |
| 4.3.3 AMI基因的PCR扩增 | 第66页 |
| 4.3.4 AMYE启动子信号肽与AMI基因的连接 | 第66-67页 |
| 4.3.5 质粒PMD 18-T-AMYE-AMI的构建 | 第67页 |
| 4.3.6 序列测定和分析 | 第67页 |
| 4.3.7 质粒PGJ103-AMYE-AMI的构建和鉴定 | 第67-69页 |
| 4.3.8 枯草感受态细胞的制备 | 第69页 |
| 4.3.9 重组质粒电击转化枯草芽孢杆菌 | 第69页 |
| 4.3.10 酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的表达 | 第69-70页 |
| 4.3.11 在AMYE启动子调控下,酰胺酶活性和表达量的测量 | 第70页 |
| 4.3.12 启动子对酰胺酶在枯草芽孢杆菌中表达的影响 | 第70页 |
| 4.3.13 蛋白质浓度测定 | 第70-71页 |
| 4.3.14 超滤 | 第71页 |
| 4.3.15 液相色谱测定产物浓度 | 第71页 |
| 4.3.16 酰胺酶转化率的测定 | 第71-72页 |
| 4.3.17 枯草芽孢杆菌中AMYE,SACB,APRE,DEGQ启动子的序列分析 | 第72页 |
| 4.4 结果和讨论 | 第72-78页 |
| 4.4.1 AMI基因,AMYE,SACB,P43,APRE和DEGQ启动子的克隆 | 第72-73页 |
| 4.4.2 重组表达载体的构建 | 第73-74页 |
| 4.4.3 酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的表达 | 第74-75页 |
| 4.4.4 酰胺酶酶活最适条件的测定 | 第75-76页 |
| 4.4.5 不同宿主表达酰胺酶的比酶活和表达量 | 第76-77页 |
| 4.4.6 酰胺酶摩尔转化率的测定 | 第77-78页 |
| 4.5 小结 | 第78-80页 |
| 五、乳酸辅酶A转移酶及乳酸辅酶A脱水酶在丙酸梭菌中的表达制备丙烯酸 | 第80-90页 |
| 5.1 前言 | 第80页 |
| 5.2 实验材料 | 第80-81页 |
| 5.3 实验方法 | 第81-85页 |
| 5.3.1 丙酸梭菌的厌氧培养 | 第81页 |
| 5.3.2 丙酸梭菌基因组的提取 | 第81-82页 |
| 5.3.3 丙酸梭菌中乳酸辅酶A转移酶及乳酸辅酶A脱水酶的克隆 | 第82页 |
| 5.3.4 PMD-18T测序鉴定 | 第82-83页 |
| 5.3.5 质粒PGJ103-LCDB-PCT的构建 | 第83-84页 |
| 5.3.6 丙酸梭菌的电转化 | 第84页 |
| 5.3.7 丙酸梭菌阳性克隆的厌氧发酵 | 第84页 |
| 5.3.8 丙烯酸的液相测定 | 第84-85页 |
| 5.3.9 PGJ103质粒在丙酸梭菌中稳定性的测定 | 第85页 |
| 5.3.10 质谱检测发酵产物 | 第85页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第85-88页 |
| 5.4.1 丙酸梭菌基因组的提取 | 第85页 |
| 5.4.2 乳酸脱水酶的B亚基及乳酸CoA转移酶PCT基因的克隆 | 第85页 |
| 5.4.3 丙酸梭菌阳性克隆的厌氧发酵 | 第85-87页 |
| 5.4.4 PGJ103质粒在丙酸梭菌中稳定性的测定 | 第87页 |
| 5.4.5 质谱检测发酵产物 | 第87-88页 |
| 5.5 小结 | 第88-90页 |
| 第六章 结论 | 第90-92页 |
| 第七章 问题与建议 | 第92-94页 |
| 参考文献 | 第94-97页 |
| 附录 | 第97-100页 |
| 致谢 | 第100-101页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第101-102页 |
| 作者和导师简介 | 第102-103页 |
| 附件 | 第103-104页 |
