| 中文摘要 | 第13-15页 |
| Abstract | 第15-16页 |
| 主要英文缩写与译名 | 第17-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-39页 |
| 1 细胞凋亡 | 第18-23页 |
| 1.1 细胞凋亡及其形态特征 | 第18页 |
| 1.2 细胞凋亡研究进展 | 第18-19页 |
| 1.3 凋亡相关基因和蛋白 | 第19-21页 |
| 1.3.1 凋亡相关蛋白结构域特征 | 第19-20页 |
| 1.3.2 Caspase家族 | 第20-21页 |
| 1.3.3 Bcl-2家族 | 第21页 |
| 1.4 细胞凋亡经典调控途径 | 第21-23页 |
| 2 家蚕丝腺凋亡 | 第23-27页 |
| 2.1 家蚕丝腺及丝腺凋亡 | 第23-24页 |
| 2.2 丝腺凋亡的研究进展 | 第24-27页 |
| 2.2.1 家蚕丝腺凋亡形态学研究 | 第24-25页 |
| 2.2.2 家蚕丝腺凋亡的信号通路研究 | 第25-26页 |
| 2.2.3 家蚕凋亡信号通路中相关基因研究 | 第26-27页 |
| 3 Dredd基因研究概况 | 第27-29页 |
| 4 第二代高通量测序 | 第29-33页 |
| 4.1 第二代高通量测序技术简介 | 第29页 |
| 4.2 lncRNA及其在家蚕中的研究进展 | 第29-31页 |
| 4.2.1 lncRNA简介 | 第29-30页 |
| 4.2.2 lncRNA调控方式 | 第30页 |
| 4.2.3 lncRNA在家蚕中研究概况 | 第30-31页 |
| 4.3 miRNA及其在家蚕中的研究进展 | 第31-33页 |
| 4.3.1 miRNA简介 | 第31-32页 |
| 4.3.2 miRNA的作用方式 | 第32页 |
| 4.3.3 miRNA在家蚕中研究进展 | 第32-33页 |
| 4.4 mRNA、lncRNA和miRNA表达的联合分析 | 第33页 |
| 5 相关实验技术介绍 | 第33-38页 |
| 5.1 dsRNA干扰 | 第33-34页 |
| 5.2 流式细胞技术检测细胞凋亡原理 | 第34-35页 |
| 5.3 实时荧光定量PCR技术 | 第35-36页 |
| 5.4 Caspase活性检测 | 第36-37页 |
| 5.5 家蚕活体质粒转染 | 第37-38页 |
| 6 技术路线 | 第38-39页 |
| 第二章 BmDredd基因的克隆与生物信息学分析 | 第39-47页 |
| 1 引言 | 第39页 |
| 2 实验材料与方法 | 第39-43页 |
| 2.1 实验材料 | 第39-41页 |
| 2.1.1 家蚕 | 第39页 |
| 2.1.2 主要试剂和试剂盒 | 第39-40页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第40-41页 |
| 2.2 实验方法 | 第41-43页 |
| 2.2.1 提取总RNA | 第41页 |
| 2.2.2 合成cDNA | 第41页 |
| 2.2.3 PCR扩增BmDredd目的片段 | 第41-42页 |
| 2.2.4 PCR产物胶回收 | 第42页 |
| 2.2.5 连接目的片段到T载体 | 第42页 |
| 2.2.6 转化DH5α感受态细胞并涂LB平板 | 第42-43页 |
| 2.2.7 质粒的提取与鉴定保存 | 第43页 |
| 2.2.8 保存甘油菌 | 第43页 |
| 2.2.9 生物信息分析所用到软件 | 第43页 |
| 3 实验结果 | 第43-46页 |
| 3.1 家蚕BmDredd基因的克隆与序列分析 | 第43-46页 |
| 4 讨论与小结 | 第46-47页 |
| 第三章 BmDredd在细胞凋亡中的功能研究 | 第47-75页 |
| 1 引言 | 第47页 |
| 2 实验材料与方法 | 第47-62页 |
| 2.1 实验材料 | 第47-50页 |
| 2.1.1 BmN细胞,sf9细胞 | 第47页 |
| 2.1.2 甘油菌及感受态细胞 | 第47页 |
| 2.1.3 主要实验试剂 | 第47-49页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第49-50页 |
| 2.2 实验方法 | 第50-62页 |
| 2.2.1 细胞复苏与传代 | 第50页 |
| 2.2.2 短波紫外线,蜕皮激素溶液,Actinmycin D溶液诱导凋亡 | 第50-51页 |
| 2.2.3 实时定量PCR分析相关基因表达量 | 第51-52页 |
| 2.2.4 dsRNA干扰 | 第52-54页 |
| 2.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 | 第54-55页 |
| 2.2.6 过表达BmDredd | 第55-57页 |
| 2.2.7 检测caspase -3/7活性 | 第57-58页 |
| 2.2.8 制备抗BmDredd多克隆抗体 | 第58-60页 |
| 2.2.9 Western bloting | 第60页 |
| 2.2.10 免疫荧光分析BmDredd基因在细胞中的定位 | 第60-62页 |
| 3 实验结果 | 第62-72页 |
| 3.1 凋亡细胞中BmDredd的实时定量 | 第62-64页 |
| 3.2 dsRNA干扰减少细胞凋亡率 | 第64-66页 |
| 3.3 在细胞中过表达BmDredd | 第66-69页 |
| 3.3.1 多片段一次性克隆 | 第66-67页 |
| 3.3.2 过表达BmDredd诱发了BmN细胞凋亡 | 第67-69页 |
| 3.3.3 过表达BmDredd诱发了sf9细胞凋亡 | 第69页 |
| 3.4 BmDredd在细胞中的定位 | 第69-71页 |
| 3.4.1 BmDreddN端和C端序列融合载体构建 | 第69页 |
| 3.4.2 免疫荧光定位 | 第69-71页 |
| 3.5 凋亡相关基因在信号通路上下游关系初步探索 | 第71-72页 |
| 4 讨论与小结 | 第72-75页 |
| 第四章 BmDredd在家蚕丝腺凋亡中的功能研究 | 第75-90页 |
| 1 引言 | 第75页 |
| 2 实验材料与方法 | 第75-79页 |
| 2.1 实验材料 | 第75页 |
| 2.1.1 家蚕 | 第75页 |
| 2.1.2 主要实验试剂 | 第75页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第75页 |
| 2.2 实验方法 | 第75-79页 |
| 2.2.1 丝腺形态学观察 | 第75-76页 |
| 2.2.2 提取总RNA、反转录合成cDNA和荧光定量基因表达量 | 第76页 |
| 2.2.3 抑制剂处理家蚕 | 第76页 |
| 2.2.4 蜕皮激素饲喂家蚕 | 第76页 |
| 2.2.5 Caspase-3/7活性的检测 | 第76页 |
| 2.2.6 提取家蚕丝腺总蛋白 | 第76-77页 |
| 2.2.7 Caspase-3活性检测 | 第77页 |
| 2.2.8 电镜 | 第77-78页 |
| 2.2.9 丝腺中过表达BmDredd | 第78-79页 |
| 2.2.10 组织免疫荧光 | 第79页 |
| 3 实验结果 | 第79-88页 |
| 3.1 丝腺器官退化消失 | 第79-81页 |
| 3.2 凋亡相关基因在五龄家蚕丝腺发育不同时期表达量 | 第81-83页 |
| 3.3 Caspase-3活性测量 | 第83-84页 |
| 3.3.1 标准曲线绘制 | 第83页 |
| 3.3.2 家蚕五龄不同时期丝腺中caspase-3活性 | 第83-84页 |
| 3.4 家蚕不同组织中BmDredd的表达 | 第84-85页 |
| 3.5 抑制剂对家蚕BmDredd表达量的影响 | 第85页 |
| 3.6 RNA干扰BmDredd延迟了丝腺退化进程 | 第85-87页 |
| 3.7 瞬时过表达BmDredd引起丝腺凋亡 | 第87-88页 |
| 4 讨论与小结 | 第88-90页 |
| 第五章 BmFadd和BmDredd的原核表达与纯化及蛋白互作研究 | 第90-101页 |
| 1 引言 | 第90页 |
| 2 材料与方法 | 第90-96页 |
| 2.1 实验材料 | 第90页 |
| 2.1.1 主要试剂和试剂盒 | 第90页 |
| 2.1.2 主要仪器设备 | 第90页 |
| 2.2 实验方法 | 第90-96页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第90-91页 |
| 2.2.2 构建含目的片段T载体 | 第91页 |
| 2.2.3 连接T载体并转化DH5α感受态细胞 | 第91页 |
| 2.2.4 线性化质粒 | 第91-92页 |
| 2.2.5 连接目的基因到原核表达载体 | 第92页 |
| 2.2.6 原核表达和Westorn blot检测目的蛋白的表达 | 第92页 |
| 2.2.7 纯化GST-fadd蛋白 | 第92-94页 |
| 2.2.8 蛋白互作 | 第94-96页 |
| 3 实验结果 | 第96-99页 |
| 3.1 GST融合蛋白的SDS-PAGE检测 | 第96-97页 |
| 3.2 WB检测GST融合蛋白表达 | 第97页 |
| 3.3 MBP融合蛋白的SDS-PAGE检测 | 第97-98页 |
| 3.4 WB检测MBP融合蛋白表达 | 第98-99页 |
| 3.5 GST-Fadd融合蛋白复性纯化 | 第99页 |
| 3.6 蛋白互作分析 | 第99页 |
| 4 讨论与小结 | 第99-101页 |
| 第六章 非编码RNA对丝腺凋亡的影响 | 第101-118页 |
| 1 引言 | 第101页 |
| 2 材料和方法 | 第101-109页 |
| 2.1 实验材料 | 第101-102页 |
| 2.1.1 家蚕 | 第101页 |
| 2.1.2 主要试剂和试剂盒 | 第101页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第101页 |
| 2.1.4 主要参考数据库 | 第101-102页 |
| 2.1.5 主要数据分析软件 | 第102页 |
| 2.2 实验方法 | 第102-109页 |
| 2.2.1 样品获取 | 第102页 |
| 2.2.2 总RNA提取及样品检测 | 第102-103页 |
| 2.2.3 测序文库构建与上机测序 | 第103-105页 |
| 2.2.4 生物信息分析流程 | 第105-107页 |
| 2.2.5 测序数据分析 | 第107-108页 |
| 2.2.6 qRT-PCR验证测序准确性 | 第108-109页 |
| 3 实验结果 | 第109-117页 |
| 3.1 测序数据浏览 | 第109-111页 |
| 3.1.1 lncRNA数据浏览 | 第109-110页 |
| 3.1.2 miRNA数据浏览 | 第110-111页 |
| 3.2 差异表达mRNAs及其GO功能分析 | 第111-112页 |
| 3.3 差异表达lncRNAs及其对mRNA的cis调控分析 | 第112-114页 |
| 3.4 差异表达miRNAs及其靶基因和GO富集性分析 | 第114-115页 |
| 3.5 lncRNA,miRNA,mRNA互作关系分析 | 第115页 |
| 3.6 测序结果的荧光定量PCR验证 | 第115-117页 |
| 4 讨论与小结 | 第117-118页 |
| 第七章 结论及后续研究展望 | 第118-120页 |
| 1. 结论 | 第118-119页 |
| 2. 创新点 | 第119页 |
| 3. 后续研究 | 第119-120页 |
| 附件一 | 第120-122页 |
| 附件二 | 第122-126页 |
| 附件三 | 第126-134页 |
| 参考文献 | 第134-147页 |
| 附录 | 第147-149页 |
| 攻读博士学位期间发表论文 | 第147-148页 |
| 参与课题 | 第148-149页 |
| 致谢 | 第149页 |
