| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 文献综述 | 第16-31页 |
| 第一章 精原干细胞与 Small RNA | 第16-24页 |
| 1.1 精原干细胞 | 第16-20页 |
| 1.1.1 精原干细胞的产生 | 第16-17页 |
| 1.1.2 精原干细胞的特征 | 第17-18页 |
| 1.1.3 精原干细胞的标记基因和调控基因 | 第18-19页 |
| 1.1.4 精原干细胞的免疫磁珠技术分选 | 第19-20页 |
| 1.2 Small RNA | 第20-22页 |
| 1.2.1 miRNA 的产生和调控 | 第20-21页 |
| 1.2.2 miRNA 的测序 | 第21-22页 |
| 1.3 miRNA 对精原干细胞的调控 | 第22-24页 |
| 第二章 miR-204 及其靶基因 Sirt1 的研究进展 | 第24-31页 |
| 2.1 miR-204 | 第24-26页 |
| 2.1.1 miR-204 的序列分析 | 第24-25页 |
| 2.1.2 miR-204 的功能 | 第25-26页 |
| 2.2 Sirt1 | 第26-30页 |
| 2.2.1 Sirtuin 家族 | 第26-27页 |
| 2.2.2 Sirt1 的功能 | 第27-30页 |
| 2.3 miR-204 靶向 Sirt1 | 第30-31页 |
| 试验研究 | 第31-86页 |
| 第三章 奶山羊精原细胞的 miRNA 表达谱 | 第31-51页 |
| 3.1 实验材料和仪器 | 第31-32页 |
| 3.1.1 实验动物和主要试剂 | 第31页 |
| 3.1.2 主要仪器 | 第31-32页 |
| 3.2 试验方法 | 第32-38页 |
| 3.2.1 主要溶液配制 | 第32页 |
| 3.2.2 奶山羊精原细胞的分离和磁珠抗体标记法分选 | 第32-33页 |
| 3.2.3 Trizol 法提取睾丸组织和细胞的 RNA 及反转录 | 第33页 |
| 3.2.4 定量 PCR | 第33-34页 |
| 3.2.5 奶山羊 CD49f 阴/阳性精原细胞差异表达 miRNA 的检测与筛选 | 第34-36页 |
| 3.2.6 miRNAs 靶基因预测及生物信息学分析 | 第36-37页 |
| 3.2.7 组织固定、切片制备及免疫荧光染色 | 第37页 |
| 3.2.8 细胞周期检测 | 第37页 |
| 3.2.9 试验数据统计 | 第37-38页 |
| 3.3 结果 | 第38-49页 |
| 3.3.1 奶山羊 CD49f 阴/阳性精原细胞的小 RNA 测序数据 | 第38-39页 |
| 3.3.2 测序 miRNAs 在奶山羊染色体上的分布 | 第39-40页 |
| 3.3.3 差异表达 miRNAs 的定量 PCR 验证 | 第40-42页 |
| 3.3.4 精原细胞富集表达的 miRNAs 在 CD49f 阳性精原细胞中高水平表达 | 第42-43页 |
| 3.3.5 差异表达 miRNAs 靶基因预测及其生物信息学分析 | 第43-46页 |
| 3.3.6 CD49f 阴/阳性精原细胞的细胞周期分析 | 第46-47页 |
| 3.3.7 CD49f 在奶山羊精原细胞中的表达 | 第47-48页 |
| 3.3.8 miR-204 和其候选靶基因 Sirt1 在分选的 CD49f 阴/阳性两类精原细胞中的表达 | 第48-49页 |
| 3.4 讨论 | 第49-50页 |
| 3.5 小结 | 第50-51页 |
| 第四章 miR-204 在奶山羊睾丸中的表达 | 第51-59页 |
| 4.1 实验材料与仪器 | 第51-52页 |
| 4.1.1 试验材料 | 第51页 |
| 4.1.2 主要仪器设备 | 第51-52页 |
| 4.2 实验方法 | 第52-54页 |
| 4.2.1 组织固定及切片制备 | 第52页 |
| 4.2.2 miR-204 在奶山羊睾丸中的 FISH 检测 | 第52-53页 |
| 4.2.3 Trizol 法提取奶山羊睾丸组织的总 RNA 及反转录 | 第53页 |
| 4.2.4 定量 PCR 检测奶山羊睾丸组织 miR-204 的表达 | 第53页 |
| 4.2.5 组织切片免疫荧光染色 | 第53页 |
| 4.2.6 构建奶山羊 chi-pri-mir-204 的慢病毒表达载体并包装病毒 | 第53-54页 |
| 4.2.7 试验数据统计 | 第54页 |
| 4.3 结果 | 第54-57页 |
| 4.3.1 miR-204 在奶山羊体内的表达 | 第54-56页 |
| 4.3.2 pCDH-CMV-EF1-GreenPuro 载体构建及病毒包装检测 | 第56-57页 |
| 4.3.3 293T 细胞超表达 chi-pri-mir-204 后检测 | 第57页 |
| 4.4 讨论 | 第57-58页 |
| 4.5 小结 | 第58-59页 |
| 第五章 Sirt1 在奶山羊睾丸中的表达及其功能分析 | 第59-71页 |
| 5.1 实验材料与仪器 | 第59-60页 |
| 5.1.1 试验材料 | 第59页 |
| 5.1.2 主要仪器设备 | 第59-60页 |
| 5.2 实验方法 | 第60-62页 |
| 5.2.1 组织固定及切片制备 | 第60页 |
| 5.2.2 Trizol 法提取奶山羊睾丸组织的总 RNA 及反转录 | 第60页 |
| 5.2.3 定量 PCR 检测奶山羊睾丸组织 Sirt1 的表达 | 第60页 |
| 5.2.4 组织切片免疫荧光染色 | 第60页 |
| 5.2.5 构建奶山羊 Sirt1 超表达载体并扩增质粒 | 第60页 |
| 5.2.6 pSirt1-IRES2-AcGFP 转染奶山羊永生化精原干细胞株 mGSCs-I-SB 后检测 | 第60页 |
| 5.2.7 miR-204 靶向 Sirt1 的预测 | 第60-61页 |
| 5.2.8 构建奶山羊 Sirt1-3'UTR 的双荧光素酶报告载体和突变载体 | 第61页 |
| 5.2.9 miR-204 靶向 Sirt1-3'UTR 的双荧光素酶实验 | 第61-62页 |
| 5.2.10 试验数据统计 | 第62页 |
| 5.3 结果 | 第62-69页 |
| 5.3.1 Sirt1 在奶山羊睾丸中的表达 | 第62-65页 |
| 5.3.2 Sirt1 促进奶山羊永生化精原干细胞株 mGSCs-I-SB 的自我更新和增殖 | 第65-67页 |
| 5.3.4 miR-204 靶向 Sirt1 的 3’UTR | 第67-69页 |
| 5.4 讨论 | 第69-70页 |
| 5.5 小结 | 第70-71页 |
| 第六章 miR-204 靶向 Sirt1 调控奶山羊精原干细胞的自我更新和增殖 | 第71-86页 |
| 6.1 材料与仪器 | 第71页 |
| 6.1.1 材料 | 第71页 |
| 6.1.2 主要仪器设备 | 第71页 |
| 6.2 实验方法 | 第71-74页 |
| 6.2.1 主要溶液配制 | 第71-72页 |
| 6.2.2 细胞转染 miR-204 模拟物 | 第72页 |
| 6.2.3 Trizol 法提取细胞的总 RNA 及反转录 | 第72页 |
| 6.2.4 定量 PCR 检测转染 miRNA 后细胞的基因表达 | 第72页 |
| 6.2.5 细胞免疫荧光染色 | 第72页 |
| 6.2.6 细胞周期检测 | 第72页 |
| 6.2.7 细胞 Brdu 检测 | 第72-73页 |
| 6.2.8 细胞凋亡检测 | 第73页 |
| 6.2.9 Western Blotting | 第73-74页 |
| 6.2.10 试验数据统计 | 第74页 |
| 6.3 结果 | 第74-84页 |
| 6.3.1 miR-204 靶向 Sirt1，抑制 Sirt1 的核酸、蛋白水平表达 | 第74-76页 |
| 6.3.2 miR-204 通过 Sirt1 影响精原干细胞自我更新和增殖基因的表达 | 第76-78页 |
| 6.3.3 miR-204 影响细胞周期 | 第78-81页 |
| 6.3.4 miR-204 影响细胞凋亡 | 第81-82页 |
| 6.3.5 超表达 miR-204 慢病毒注射小鼠曲细精管 | 第82-84页 |
| 6.4 讨论 | 第84-85页 |
| 6.5 小结 | 第85-86页 |
| 结论 | 第86页 |
| 本研究的创新点与进一步研究的课题 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-94页 |
| 附录 | 第94-105页 |
| 缩略词 | 第105-106页 |
| 致谢 | 第106-107页 |
| 作者简介 | 第107页 |
